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提升CUT&Tag技能,就不怕卷單細胞ChIP技術了

2023-6-25  閱讀(386)

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要問DNA-蛋白質互作技術誰最火?就不得不提CUT&Tag技術了!CUT&Tag技術自2019年問世以來,不斷突破創新,從最初只能做組蛋白修飾,到現在越來越多轉錄因子見刊,甚至各種R-loop、G4結構的研究也被大量報道。更不要說單細胞技術爆火的現在,scCUT&Tag技術中,各種動物、細胞以及植物的文章見刊,并且CUT&Tag技術還衍生出了多靶標CUT&Tag,實現一個細胞,多個靶標的研究。

 

 
CUT&Tag技術發展歷程
 
 
 
2019年4月  發表
 
2020年  大量組蛋白修飾、少量轉錄因子研究見刊
 

2021年 大量轉錄因子研究見刊

 

2021年1月  scCUT&tag在動物應用方向研究見刊

 
2021年12月  scCUT&tag在植物應用研究見刊
 
2022年3月  scCUT&tag +scRNA-seq單細胞多組學聯合應用見刊
 
2022年3月  CUT&Tag2for1技術推出
 

2022年12月  nano-CUT&Tag推出

 

更多應用持續更新……


 

最近經常聽到單細胞ChIP技術,小翌立馬查閱資料去一探究竟,結果發現還是換湯不換藥,這個單細胞ChIP技術不就是咱們scCUT&Tag么?

 

為了幫助大家提升CUT&Tag實驗技能,小翌整理了之前的一些CUT&Tag知識,同時將CUT&Tag實驗的甲醛交聯方案和CUT&Tag-qPCR方案一起匯總,希望大家進一步提升CUT&Tag技能,后續如果也想嘗試單細胞ChIP,或者是已經在做單細胞ChIP,咱們也能更得心應手。

 

 

 

CUT&Tag甲醛交聯方案

 
1.對于細胞樣本,將甲醛溶液加入細胞培養皿中,使甲醛終濃度為0.1%,室溫條件下,搖床上交聯2-5 min(若是目的蛋白表達水平過低可以適當延長交聯時間到10 min) ,交聯結束后,立即加入甘氨酸到培養皿中(終濃度0.1 M),搖床繼續搖15 min以終止交聯,然后進行后續的細胞捕獲(對于部分弱結合的轉錄因子,可將甲醛調為0.2%);
 
2.對于組織樣本,將組織用剪刀剪成小塊后加預冷的PBS(含1%BSA),加入甲醛溶液使甲醛終濃度為0.1%,室溫搖床上搖2-5 min(若是目的蛋白表達水平過低可以適當延長交聯時間到10 min) ,交聯結束后,立即加入甘氨酸到培養皿中(終濃度0.1 M),搖床繼續搖15 min以終止交聯,之后,用組織勻漿器勻漿,將組織勻漿后的溶液過細胞篩以獲取細胞懸液,然后進行后續的細胞捕獲(對于部分弱結合的轉錄因子,可將甲醛調為0.2%)。
 

【注】

A:在CUT&Tag實驗開始前,我們需要確定實驗方案。隨著CUT&Tag技術的發展,科學家們發現有些目標蛋白質在研究時,輕微甲醛交聯效果更好。之后,更多的研究表明,使用CUT&Tag技術研究不同蛋白時,所需的實驗條件也不一樣。做組蛋白修飾、強結合的轉錄因子(如CTCF、RNA polll等)無需甲醛交聯。而一些弱結合的轉錄因子或轉錄輔因子則需要甲醛交聯,并且甲醛交聯的強度也不一樣。常規的輕微甲醛交聯條件為0.1%甲醛室溫交聯2 min,之后用0.1 M甘氨酸終止交聯。

 

B:若在實驗時,有添加甲醛進行輕微交聯,那么后續加終止buffer后,步驟稍微有調整哦!甲醛交聯后,蛋白酶K消化步驟調整為:向每個樣品中加入2 μL 15× Terminate Solution、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30× Proteinase K(此時磁珠會板結)(若樣品較多,可一起提前配制)。全速渦旋樣品約10 sec,混勻后瞬離,將樣品置于PCR儀,55 oC消化2 h (熱蓋不低于70 oC)或者37 oC過夜。

 

 

 

CUT&Tag-qPCR方案

 
目前做CUT&Tag-qPCR時,有兩種,一種是蛋白酶K消化和gDNA提取后直接qPCR實驗,一種是完成建庫后進行qPCR。這兩種方式都有文獻可參考。目前翌圣更推薦完成建庫后進行qPCR實驗。

 

 
 
 

qPCR 定量檢測

qPCR試劑以翌圣的Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(Cat#11184)為例。

 

 
 
 

反應體系(推薦冰上配制)

 

使用前務必充分混勻,避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 引物濃度:通常引物終濃度為0.2 μM,也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
b) 模板濃度如模板類型為未稀釋cDNA原液,使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
c) 模板稀釋cDNA原液建議5-10倍稀釋,最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。
d) 反應體系推薦使用20 μL或50 μL,以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
e) 體系配制請于超凈工作臺內配制,并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管;推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染。

 

 
 
 

反應程序

 

快速程序適用于絕大多數基因,個別復雜二級結構基因可嘗試標準程序。

a退火溫度和時間請根據引物和目的基因的長度進行調整。

b熒光信號采集請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置,幾種常見儀器的時間設定如下:

20 secApplied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 secApplied Biosystems 7300

32 secApplied Biosystems 7500

c熔解曲線:通常情況下可以使用儀器默認程序。

 

 

 
 
 

結果分析

定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。
1) 擴增曲線:標準擴增曲線為S型。
Ct值落在20-30之間時,定量分析最準確;
Ct值小于10時,需要將稀釋模板后,重新進行實驗;
Ct值介于30-35之間時,需要提高模板濃度,或者增大反應體系的體積,以提高擴增效率,保證結果分析的準確性;
Ct值大于35時,檢測結果無法定量分析基因的表達量,但可用于定性分析。
 
2) 熔解曲線:
熔解曲線單峰,表明反應特異性好可以進行定量結果分析;若熔解曲線出現雙峰或者多峰,則不能進行定量分析。
熔解曲線出現雙峰,需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體,建議降低引物濃度,或者重新設計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增,請提高退火溫度,或者重新設計更高特異性的引物。

 

圖:spike in normalization前,同一基因在不同投入量細胞結果中,基因的富集倍率差異較大,qEVX1和HOX在100w和10w投入量中,基因不富集,在1w cell投入中,基因富集。

 

圖:使用試劑盒中的spike in 2進行normalization處理,同一基因在不同投入量細胞結果中,基因的高集倍率差異不大。

圖:使用試劑盒中的spikein 3進行normalization處理,同一基因在不同投入量細胞結果中,基因的富集倍率差異不大。

 

CUT&Tag技術帖列表:
 
 
 
 
 

1、Plant Cell | CUT&Tag聯合RNA-seq測序,解析大豆根瘤衰老的調控機制

 

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