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要問DNA-蛋白質互作技術誰最火?就不得不提CUT&Tag技術了!CUT&Tag技術自2019年問世以來,不斷突破創新,從最初只能做組蛋白修飾,到現在越來越多轉錄因子見刊,甚至各種R-loop、G4結構的研究也被大量報道。更不要說單細胞技術爆火的現在,scCUT&Tag技術中,各種動物、細胞以及植物的文章見刊,并且CUT&Tag技術還衍生出了多靶標CUT&Tag,實現一個細胞,多個靶標的研究。
2021年 大量轉錄因子研究見刊
2021年1月 scCUT&tag在動物應用方向研究見刊
2022年12月 nano-CUT&Tag推出
更多應用持續更新……
最近經常聽到單細胞ChIP技術,小翌立馬查閱資料去一探究竟,結果發現還是換湯不換藥,這個單細胞ChIP技術不就是咱們scCUT&Tag么?
為了幫助大家提升CUT&Tag實驗技能,小翌整理了之前的一些CUT&Tag知識,同時將CUT&Tag實驗的甲醛交聯方案和CUT&Tag-qPCR方案一起匯總,希望大家進一步提升CUT&Tag技能,后續如果也想嘗試單細胞ChIP,或者是已經在做單細胞ChIP,咱們也能更得心應手。
CUT&Tag甲醛交聯方案
【注】
A:在CUT&Tag實驗開始前,我們需要確定實驗方案。隨著CUT&Tag技術的發展,科學家們發現有些目標蛋白質在研究時,輕微甲醛交聯效果更好。之后,更多的研究表明,使用CUT&Tag技術研究不同蛋白時,所需的實驗條件也不一樣。做組蛋白修飾、強結合的轉錄因子(如CTCF、RNA polll等)無需甲醛交聯。而一些弱結合的轉錄因子或轉錄輔因子則需要甲醛交聯,并且甲醛交聯的強度也不一樣。常規的輕微甲醛交聯條件為0.1%甲醛室溫交聯2 min,之后用0.1 M甘氨酸終止交聯。
B:若在實驗時,有添加甲醛進行輕微交聯,那么后續加終止buffer后,步驟稍微有調整哦!甲醛交聯后,蛋白酶K消化步驟調整為:向每個樣品中加入2 μL 15× Terminate Solution、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30× Proteinase K(此時磁珠會板結)(若樣品較多,可一起提前配制)。全速渦旋樣品約10 sec,混勻后瞬離,將樣品置于PCR儀,55 oC消化2 h (熱蓋不低于70 oC)或者37 oC過夜。
CUT&Tag-qPCR方案
qPCR 定量檢測
反應體系(推薦冰上配制)
反應程序
【注】
快速程序適用于絕大多數基因,個別復雜二級結構基因可嘗試標準程序。
a) 退火溫度和時間:請根據引物和目的基因的長度進行調整。
b) 熒光信號采集(★):請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置,幾種常見儀器的時間設定如下:
20 sec:Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast
31 sec:Applied Biosystems 7300
32 sec:Applied Biosystems 7500
c) 熔解曲線:通常情況下可以使用儀器默認程序。
結果分析
圖:使用試劑盒中的spikein 3進行normalization處理,同一基因在不同投入量細胞結果中,基因的富集倍率差異不大。
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