蛋白質相互作用質譜分析是研究蛋白質間相互作用網絡的重要技術，廣泛應用于疾病機制、信號通路解析和藥物靶點發現等領域。以下是其核心內容和關鍵步驟的整理：
1. 基本原理
目標：通過質譜技術鑒定與目標蛋白（bait protein）直接或間接結合的蛋白質。
策略：結合生化富集（如免疫共沉淀、親和純化）和高靈敏度質譜分析。
2. 實驗流程
(1) 樣品制備
蛋白復合體富集：
免疫共沉淀（Co-IP）：利用抗體捕獲目標蛋白及其互作蛋白。
親和純化（AP-MS）：使用標簽（如Flag、HA）純化重組蛋白復合物。
交聯技術（Crosslinking）：穩定瞬時或弱相互作用（如甲醛交聯）。
裂解條件優化：使用溫和裂解緩沖液避免復合體解離，添加蛋白酶抑制劑。
(2) 質譜分析
液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）：
酶解：用胰蛋白酶消化蛋白質為肽段。
分離：通過液相色譜分離肽段。
檢測：高分辨率質譜（如Orbitrap、Q-TOF）分析肽段序列。
定量方法：
標記定量：TMT、SILAC（標記不同樣本的蛋白質）。
無標記定量（Label-free）：基于肽段信號強度比較。
(3) 數據分析
數據庫搜索：
工具：MaxQuant、Proteome Discoverer、Mascot。
數據庫：UniProt、Swiss-Prot。
互作蛋白篩選：
排除污染物（如角蛋白）和常見非特異性結合蛋白。
對比陰性對照組（如空載體或無關抗體樣本）。
生物信息學分析：
功能注釋：GO、KEGG分析互作蛋白的生物學功能。
網絡構建：使用Cytoscape可視化互作網絡。
驗證工具：STRING數據庫預測互作可靠性。
3. 關鍵挑戰與解決方案
假陽性/假陰性：
嚴格對照：設置多個陰性對照（如IgG對照、敲除目標蛋白的細胞）。
統計學過濾：基于顯著性（p-value）和豐度倍數變化篩選。
弱/瞬時相互作用：
使用交聯劑（如DSS）穩定復合物。
提高質譜靈敏度（如DIA模式）。
數據復雜性：
機器學習輔助篩選（如SAINT、CRAPome數據庫去污染）。
4. 應用場景
疾病機制：發現癌癥中異常互作的蛋白（如EGFR信號網絡）。
藥物靶點：鑒定藥物（如激酶抑制劑）結合的蛋白復合物。
結構生物學：結合冷凍電鏡解析復合體結構。
5. 前沿技術
交聯質譜（CX-MS）：直接鑒定互作位點。
鄰近標記技術（如BioID、TurboID）：在活細胞中標記鄰近蛋白，提高空間特異性。
單細胞質譜：研究細胞異質性中的蛋白互作。
6. 注意事項
實驗設計：至少3次生物學重復以提高可信度。
樣本處理：避免反復凍融和過度離心。
數據分析：多軟件交叉驗證結果（如同時使用MaxQuant和PD）。
如果需要進一步探討具體實驗方案或數據分析工具，可以提出更詳細的問題！
