Q1: 蛋白質糖基化分析的常用方法有哪些？

A1: 核心方法包括：

1、色譜分析（Chromatography）

色譜法可根據糖鏈或糖蛋白的理化特性進行有效分離。在糖基化分析中，常用的液相色譜技術（如HILIC、陰離子交換色譜）可用于分離不同糖型結構，或將糖蛋白從復雜樣品中分離出來，適合進行糖鏈圖譜構建和差異比較分析。

2、凝集素結合分析（Lectin Binding Assays）

凝集素是一類能結合特定碳水化合物結構的蛋白。利用不同凝集素的選擇性結合能力，可對特定類型的糖鏈（如唾液酸、半乳糖、甘露糖等）進行識別。這類方法適用于檢測糖基化修飾的存在與變化，常用于初篩分析或條件比較實驗。

3、酶學分析（Enzymatic Assays）

通過使用特異性糖苷酶（如PNGase F、O-glycosidase），可以去除或切割特定類型的糖鏈，從而判斷糖鏈類型、定位糖基化位點，或研究其對蛋白功能的影響。

4、糖鏈標記（Glycan Labeling）

采用熒光或化學標記方法對糖鏈進行標記，可提高檢測靈敏度并實現可視化追蹤。標記后的糖鏈可用于定量分析、顯微成像或流式檢測，是研究糖鏈分布和豐度變化的有效工具。

Q2: 如何區分N-糖基化和O-糖基化？

A2: N-糖基化和O-糖基化的區分主要基于修飾位點、糖鏈結構、修飾時機及其功能差異。

首先，兩者附著的氨基酸殘基不同。N-糖基化發生在天冬酰胺（Asn）殘基上，且通常出現在Asn-X-Ser/Thr的特定位點序列中（X不能為脯氨酸）；而O-糖基化則修飾絲氨酸（Ser）或蘇氨酸（Thr）殘基，不依賴特定序列。

其次，糖鏈的核心結構顯著不同。N-糖鏈擁有一個保守的高甘露糖型核心（Man?GlcNAc?），而O-糖鏈則展現出更豐富的結構多樣性，例如core 1、core 2、core 3等。

此外，修飾時機也不同。N-糖基化在蛋白質翻譯過程中進行（共翻譯修飾），有助于蛋白折疊與轉運；O-糖基化則是在蛋白質合成和初步折疊完成后進行（翻譯后修飾），多用于調控細胞間識別和黏附。

最后，兩者在生物學功能上也有區分。N-糖基化更傾向于參與蛋白穩定性維持和胞內運輸，而O-糖基化則在免疫應答、細胞信號轉導及分化調控中發揮重要作用。

通過這些方面的綜合判斷，可有效區分N-糖基化與O-糖基化。

Q3: 蛋白質糖基化分析前，是否需要對樣本進行脫糖處理？

A3: 是否進行脫糖處理需依據分析目的和糖基化類型而定，不能一概而論。

若研究目標是解析糖鏈結構或定位糖基化位點，則應保留糖鏈進行分析。此時通常配合糖肽富集策略和高分辨質譜技術，以zuì dà chéng dù保留原始修飾信息，避免因脫糖導致位點信息丟失。

若目的是提高非修飾肽段的檢出率、簡化譜圖背景，或進行總蛋白/肽段定量，則可選擇性進行脫糖處理，以降低糖鏈對電離效率、保留時間和碎裂模式的干擾，提升數據解析質量。

需要注意的是，不同脫糖酶（如PNGase F、Endo H、O-glycosidase等）具有特定底物特異性，它們只能去除某些類型的糖鏈。例如，PNGase F能高效去除大多數N-糖，但不適用于O-糖或某些修飾封閉的結構。因此，酶的選擇應根據目標蛋白的具體糖型特征合理設定，以確保脫糖的準確性和有效性。

Q4: 進行糖基化分析時，蛋白樣本需要去鹽脫脂嗎？

A4: 需要。高鹽和脂類雜質會嚴重干擾LC-MS/MS分析，建議用濾膜離心或C18固相萃取進行脫鹽處理，確保樣品清潔度。

Q5: 蛋白糖基化分析的主要干擾因素有哪些？

A5: 包括非糖修飾共存（如磷酸化、乙酰化）、鹽離子干擾、樣品降解、非特異結合及質譜背景噪音等。

Q6: 蛋白質糖基化后分子量增加多少?

A6：蛋白質糖基化后分子量的增加取決于糖鏈的類型和長度。

●  N-糖基化：通常增加約 1.2–3 kDa，復雜型或高度分支結構可超過 5 kDa。

●  O-糖基化：單個核心結構如core 1約增加 365 Da，多糖鏈聚合時可累計達數千道爾頓。

需要注意的是，實際分子量增幅具有多樣性，需結合具體糖型和位點數，通過質譜精確測定。

Q7: 蛋白質糖基化分析為什么要去糖基化？

A7: 去糖基化在蛋白質糖基化分析中主要用于消除糖鏈對蛋白主鏈結構解析的干擾，從而更清晰地分析肽段本體。這一處理有助于暴露潛在的糖基化位點，簡化質譜譜圖，提高蛋白序列的識別精度。同時，去除糖鏈后可避免不同糖型或連接方式帶來的異質性干擾，使后續的結構或功能研究更具針對性和一致性。

Q8: 如何防止糖鏈在樣品處理過程中脫落？

A8：保持中性或弱酸性pH，避免高溫和長時間孵育操作，盡量在4°C下進行處理步驟以保護糖鏈穩定性。

Q9: 樣品中是否需去除高豐度蛋白？

A9：若使用的是血清、血漿等體液樣本，建議去除如白蛋白、免疫球蛋白等高豐度成分，以提高低豐度糖蛋白的檢測靈敏度。

關于我們

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫療器械行業提供質量控制檢測和項目驗證等專業服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系，數據冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發、藥物申報注冊和生產放行。

1.公司采用ISO9001質量控制體系，專業提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規的藥物質量研究服務；

3.業務范圍覆蓋蛋白質組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等；

4.七大質量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求；

5.服務3000+企業，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優質的生物質譜分析服務!