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樣本采集與保存
采集:根據檢測目的確定采樣部位。若檢測水稻種子,要確保種子無霉變、蟲蛀,隨機選取一定數量的種子,一般不少于 100 粒,以保證樣本的代表性。對于水稻植株,可采集葉片,選取生長良好、無病蟲害的葉片,用干凈剪刀剪取適量,一般每份樣本采集 1 - 2 克葉片。
保存:采集后的樣本需及時處理。若不能立即處理,種子可置于干燥、陰涼處保存,避免受潮;葉片樣本可放入自封袋中,排除空氣后密封,放入冰箱冷藏(4℃左右),保存時間不宜超過 3 天,以防核酸降解。
樣本研磨
設備選擇:可使用研缽和研杵手動研磨,也可選用組織研磨儀等電動設備。手動研磨適合少量樣本,操作簡單但效率較低;組織研磨儀能同時處理多個樣本,效率高且研磨效果均勻。
操作步驟:將樣本放入研缽或研磨儀的研磨管中,加入適量的液氮(液氮可使樣本迅速冷凍,便于研磨)。若用手動研缽,用研杵快速研磨樣本,直至呈粉末狀;若用組織研磨儀,設置合適的研磨時間和頻率,一般研磨時間為 1 - 3 分鐘,頻率為 20 - 30 次/秒,研磨完成后樣本也應呈均勻粉末狀。
核酸提取
試劑選擇:常用的核酸提取試劑有 CTAB 法試劑盒、磁珠法試劑盒等。CTAB 法試劑盒成本較低,但操作步驟相對復雜;磁珠法試劑盒操作簡便、快速,且提取的核酸純度較高。
操作流程:以 CTAB 法為例,將研磨好的樣本粉末轉移至離心管中,加入 CTAB 提取液,65℃水浴 30 - 60 分鐘,期間不時顛倒混勻。水浴后加入氯仿 - 異戊醇(24:1),輕輕顛倒混勻,12000 rpm 離心 10 - 15 分鐘。取上清液轉移至新的離心管中,加入異丙醇,輕輕顛倒混勻,-20℃沉淀 30 分鐘以上。12000 rpm 離心 10 分鐘,棄上清,用 75%乙醇洗滌沉淀 2 次,晾干后加入適量的 TE 緩沖液溶解核酸。
核酸純化與濃度測定
純化:可使用乙醇沉淀、柱純化等方法進一步純化核酸。乙醇沉淀可去除殘留的鹽離子和小分子雜質;柱純化則利用特定的吸附柱,能高效去除雜質,提高核酸的純度。
濃度測定:使用紫外分光光度計測定核酸的濃度和純度。一般核酸在 260 nm 處有最大吸收峰,通過測量 260 nm 和 280 nm 處的吸光度值,計算 A260/A280 的比值。比值在 1.8 - 2.0 之間說明核酸純度較高,可用于后續檢測。根據測定的濃度,將核酸稀釋至合適的濃度,一般轉基因水稻檢測中核酸濃度控制在 10 - 100 ng/μL。
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