泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是一種高度調(diào)控的機(jī)制，通過(guò)蛋白質(zhì)的泛素化和降解來(lái)控制許多細(xì)胞過(guò)程。泛素通過(guò)其C末端與目標(biāo)蛋白上的賴(lài)氨酸殘基結(jié)合，可以以單體形式或聚合鏈形式存在。泛素鏈可以通過(guò)泛素的第一個(gè)甲硫氨酸（M1）形成線(xiàn)性鏈，也可以通過(guò)其七個(gè)賴(lài)氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）形成特定賴(lài)氨酸鏈。K48和K63連接的泛素鏈?zhǔn)羌?xì)胞中最為主要的多泛素化形式。

泛素化是一個(gè)可逆的過(guò)程，去泛素化酶（DUBs）可以去除目標(biāo)蛋白上的泛素，從而拯救它們免于蛋白酶體降解。確定目標(biāo)蛋白上的多泛素化程度和類(lèi)型對(duì)于理解它們?cè)谡＜?xì)胞過(guò)程以及與UPS相關(guān)疾病狀態(tài)中的泛素介導(dǎo)調(diào)控至關(guān)重要。傳統(tǒng)上，這些過(guò)程是通過(guò)質(zhì)譜分析或使用抗泛素抗體進(jìn)行免疫沉淀后，再進(jìn)行免疫印跡來(lái)監(jiān)測(cè)的。然而，在免疫印跡步驟中，由于表位掩蓋、親和力降低或蛋白質(zhì)多泛素化導(dǎo)致的選擇性變化，底物抗體常常與底物的多泛素化形式產(chǎn)生不同的相互作用。

圖1：UbiTest檢測(cè)的示意圖：通過(guò)磁性TUBEs捕獲富集泛素化蛋白，然后從TUBEs中洗脫。分離的多泛素化洗脫液被分成兩部分：一部分保持未處理狀態(tài)，而第二部分用廣譜去泛素化酶（DUB）消化以去除泛素鏈。兩部分均使用針對(duì)目標(biāo)蛋白（POI）的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。從多泛素化POI上去除泛素鏈后，在免疫印跡中可以看到一個(gè)單一的、未修飾的POI條帶。

一種更明確的證明蛋白質(zhì)泛素化的方法是，在免疫印跡分析之前，將免疫沉淀與使用廣譜去泛素化酶（DUB）進(jìn)行去泛素化相結(jié)合。如果在經(jīng)過(guò)DUB處理后，目標(biāo)蛋白（POI）的信號(hào)增強(qiáng)，這表明該蛋白即使在未處理的樣本中沒(méi)有明顯的反應(yīng)性，也已經(jīng)發(fā)生了泛素化。

LifeSensors的UbiTest檢測(cè)利用TUBEs（串聯(lián)泛素結(jié)合實(shí)體）來(lái)捕獲多泛素化蛋白，以避免由于POI免疫反應(yīng)性變化而可能出現(xiàn)的問(wèn)題。TUBEs是經(jīng)過(guò)工程改造的串聯(lián)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與多泛素的解離常數(shù)在納摩爾范圍內(nèi)。LifeSensors的泛選擇性TUBEs已被證明能夠結(jié)合所有八種泛素連接類(lèi)型。

為了確定目標(biāo)蛋白上多泛素化的連接類(lèi)型，LifeSensors開(kāi)發(fā)了一種更具針對(duì)性的方法，該方法在免疫印跡分析之前使用特定連接類(lèi)型的DUB。如果在經(jīng)過(guò)K48/K63特異性DUB處理后，與未修飾POI對(duì)應(yīng)的條帶信號(hào)增強(qiáng)，則表明該蛋白發(fā)生了K48/K63多泛素化。

艾美捷UbiTest緩沖液（#LSS-UM-0411-3000）相關(guān)產(chǎn)品：

UE103：UbiQuant S試劑盒  

UE905：UbiQuant Ultra微孔板  

UM413：K63連接特異性UbiTest試劑盒——瓊脂糖TUBE洗脫試劑盒  

UM201-1MG：抗泛素TUBE 1，His6  

UM102：TUBE 2（GST）