前言：熒光定量PCR是1996年由美國Applied Biosystems 公司推出的。經(jīng)過二十年的發(fā)展，該技術已經(jīng)被廣泛應用于臨床疾病診斷各種傳染病診斷和療效評價；臨床疾病診斷動物疾病檢測；食源微生物、食品過敏源、轉基因研究等食品安全操作等等各個領域。

1、基因分型

例如SNP檢測，甲基化檢測等。

SNP檢測是確定一對染色體的每種基因的兩個拷貝，哪種點突變在這兩個拷貝中存在，因此利用熒光定量PCR方法，并配合芯片技術可以快速靈敏的檢測到SNP結果。

DNA甲基化是Z早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉變?yōu)?span style="font-family: Calibri;">5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。

2、基因表達差異分析

例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結果的確證 。

基因表達差異通常是指一個基因在兩個條件中表達水平的檢測值在排除實驗、檢測等因素外，達到一定的差異，具有統(tǒng)計學意義，同時也具有生物學意義。

3、DNA 或RNA 的定量分析

包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。基因失活是指利用反義技術，使非正常基因或有害基因不表達或降低表達活性，以達到治療某些特定疾病的目的。

實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴增反應中的每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現(xiàn)對起始模板的定性及定量分析。

實時熒光定量PCR系統(tǒng)知識匯總

1.在qPCR 技術中重要的參數(shù)指標有哪些？

擴增及溶解曲線：擴增曲線是PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態(tài)進程；溶解曲線是用來驗證擴增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會出現(xiàn)單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現(xiàn)至少兩個峰。

熒光域值（threshold）: 是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍，即：threshold。

Ct 值：是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。將已知濃度的標準品梯度稀釋進行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在線性關系，可以制作標準曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標準曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。

2.擴增曲線一般分為哪幾個階段

熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。在qPCR擴增早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化，此時即為基線期，

PCR反應過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應循環(huán)數(shù)的增加，zui終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板，從而進入平臺期，在該時期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關系，只有在熒光信號的指數(shù)增長期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

3.ROX染料是什么作用？

ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應中能被qPCR儀檢測到。ROX不參與qPCR反應，熒光信號值不會隨著qPCR擴增而改變。實驗過程中很多因素會引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學因素（液滴、氣泡）的因素，反應體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽性參比，對其他熒光信號進行歸一化校正，以提高數(shù)據(jù)的較精確度。

4.Ct值多少才算理想

一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴增，但也不是的，需要輔以溶解曲線加以解釋。

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