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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
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產品介紹
產品簡介
rProtein A/G IP/Co-IP kit (蛋白A/G免疫（共）沉淀試劑盒)是一種通過高質量的重組Protein A/G磁珠，配合用戶自備的特異性抗體，進行目的蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的試劑盒。本試劑盒包含足夠完成40個反應的試劑，每個反應使用25 uL磁珠，同時可進行10個陰性對照。
rProtein A/G免疫沉淀磁珠使用“納米表面生物技術"(S-TEC)，將rProtein A/G高密度定向包被到粒徑為200 nm的納米磁珠表面，納米級磁珠提供的超大比表面積，具有更多的結合位點、更高的抗體結合能力和極低的蛋白非特異性吸附率。蛋白A/G免疫（共）沉淀試劑盒配有經過優化驗證的必要試劑，為免疫（共）沉淀實驗提供了最佳的反應條件，增強了免疫（共）沉淀實驗的穩定性。本產品可廣泛應用于細胞裂解物、細胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫（共）沉淀反應。
天然蛋白A（Protein A）是一種發現于金黃色//葡萄//球菌的細胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細胞表面蛋白，二者功能相似，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區相互作用，可結合大多數哺乳動物的IgG，但在兩者結合特異性上有所不同。rProtein A/G免疫磁珠同時共價偶聯了蛋白A和蛋白G，比單獨的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結合范圍，實用性更高。同時，本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時也去除了天然蛋白本身的非主要結合域以降低非特異性結合。
產品信息
類別 | 編號 | 組分名稱 | 36421ES40（40T） | 保存方式 | 翌圣貨號 |
Part Ⅰ | 36421-A | Lysis Buffer for IP Assays 免疫沉淀用(IP)裂解液 | 100 mL | -25~-15℃ | 20118ES |
36421-B | 蛋白酶抑制劑Cocktail,EDTA-free,100×DMSO儲液 | 1 mL | -25~-15℃ | 20124ES | |
36421-C | Mouse IgG(1mg/mL) | 25 uL | -25~-15℃ | 36111ES | |
36421-D | Rabbit IgG(1mg/mL) | 25 uL | -25~-15℃ | 36113ES | |
36421-E | 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 | 1 mL | -25~-15℃ | 20315ES | |
Part Ⅱ | 36421-F | rProtein A/G MagBeads (IP Grade) | 1 mL | 2~8℃ | 36417ES |
36421-G | 1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L | 1 L | RT | 60157ES | |
36421-H | 洗脫緩沖液 | 5 mL | 2~8℃ | N/A | |
36421-I | 中和緩沖液 | 1 mL | 2~8℃ | N/A |
儲存條件
Part Ⅰ-25~-15℃保存；Part Ⅱ2~8℃保存；有效期1年。
Part Ⅱ中的rProtein A/G MagBeads (IP Grade)，避免冷凍。
使用說明
工作液濃度應根據具體實驗確定，建議進行預實驗摸索最佳實驗濃度。
緩沖液配制
裂解緩沖液：免疫沉淀用(IP)裂解液（36421-A）可解凍后直接使用。
平衡/結合/洗雜緩沖液：1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L（36421-G）, 使用時用蒸餾水或超純水溶解，定容至1L即可。
洗脫緩沖液：洗脫緩沖液（36421-H）可直接使用。
中和緩沖液：中和緩沖液（36421-I）可直接使用。
SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制：取適量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)（36421-E）用水稀釋5倍即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。
抗原樣品制備
本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據不同來源的抗原樣品選擇適當的方式進行預處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。
血清樣品處理：若目標蛋白豐度較高， 建議用結合緩沖液稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
貼壁細胞樣品處理：移去培養基，用PBS清洗細胞兩遍；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5mL EP管內，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
大腸桿菌樣品處理： 離心收集大腸桿菌（4℃, 12000g, 2 min），棄上清后稱重， 按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5-10 mL的比例加入結合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑Cocktail，重懸菌體，超聲裂解細胞，離心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。
磁珠預處理
將磁珠漩渦振蕩1 min，使其充分混懸；
取25 µL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄保護液。
加入200 µL結合緩沖液洗滌，進行磁性分離，吸棄上清，重復1次。
4. 抗體吸附
1) 加入目標抗體溶液（2-10 µg抗體總量），充分混勻。
2) 室溫孵育 10 min，可以振蕩或漩渦混合均勻。
3) 將EP 管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。如需要可留做進一步檢測。
4) 加入500 μL 洗雜液混合均勻，置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。重復洗雜至少 3次。
可選做：使用抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比或終濃度的正常IgG工作液，以用于去除非特異性結合或作為陰性對照。所謂種屬相同的正常IgG是指，例如后續免疫沉淀時用的抗體是小鼠IgG，則在本步驟中可以用TBS稀釋適量的Mouse IgG等以用于降低背景或作為陰性對照。
5. 抗原結合反應
1) 加入含有抗原的樣品（通常300-500 μL，每個免疫沉淀反應推薦的總蛋白量為 500 ~1500 μg)，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復合物均勻分散。
2) 在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管 10 min，使抗原與抗體充分結合，如結合力較弱則可在室溫下反應1h或者在4℃下反應過夜。
3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復合物進行磁性分離，收集上清液，以備后續檢測。
4) 向離心管中加入1 mL洗雜液，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復合物均勻分散，然后進行磁性分離，棄上清液；從磁分離器上取下離心管，再重復洗滌兩次。
6．抗原洗脫
A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。
1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱 5min。
2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集上清液進行SDS-PAGE檢測。
B. 非變性洗脫
1) 向磁珠-抗體-抗原復合物中加入100 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育10 min。
2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。
3) 重復步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。
注意事項
1. 請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導致磁珠聚集而降低結合能力。
2. 本試劑盒提供的Lysis Buffer for IP Assays經反復測試，適合很多情況下的免疫沉淀或免疫共沉淀時的樣品裂解和后續的洗滌。但 IP 實驗中不同類型的抗體與抗原結合的親和性是有區別的，抗體與抗原結合還會受到 Lysis/Wash Buffer 的影響，因此可自行優化操作細節或者篩選及配制緩沖液進行實驗。
3. 本產品僅作科研用途。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
