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DNA甲基化（5mC）可在腫瘤發生的早期被檢測到，具有較好的穩定性，是腫瘤液體活檢中一個價值的標志物。DNA甲基化檢測首先要進行甲基轉化，常見的分析方法是使用化學品或酶，以不同的方式與甲基化修飾的C及未修飾的C發生反應，從而將兩者區分開。目前有兩種策略，一種是通過將非甲基化的C轉化為U，如重亞硫酸氫鹽轉化法（BS-Seq）、EM-seq等；另一種是將甲基化的C轉化為U，如TAPS等。
表1. 轉化技術對比
技術 | 優勢 | 缺點 |
BS-seq | 轉化效率高，可達到99%以上 | 模板損傷大；高投入量、低有效數據量；覆蓋率低；堿基不平衡 |
EM-seq | 模板損傷少；覆蓋率高 | 轉化率低；堿基不平衡 |
TAPS | 模板損傷少；正向轉化，堿基平衡 | 脫氨基過程中產生的DHU堿基在PCR擴增過程中可能會產生一定的偏好 |
傳統的BS-seq被認為是甲基化分析的金標準，但存在明顯的限制：對DNA損傷大，影響模板利用率；非甲基化C轉化為T，基因組堿基不平衡；難以區分5mC和5hmC（另一種重要的甲基化類型，區分5mC和5hmC水平具有重要的臨床意義）。最近開發的酶學檢測技術解決了DNA損傷的問題，但還存在一定局限性，如DNA樣本需求量大、不能區分5mC和5hmC等。
為解決上述檢測問題，美國賓夕法尼亞大學研究團隊在Nature Chemical Biology上發表了題為“Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution"的文章。其開發了一種DNA甲基化測序新方法：直接甲基化測序（DM-Seq）。DM-Seq可保持基因組堿基平衡：轉化過程中，非甲基化C與5hmC不變，5mC轉化為T；使用酶法處理：靈敏度高，不損害樣本；少量DNA樣本就可以在單堿基分辨率下對5mC進行分析，有望應用于液體活檢和早期癌癥檢測等。
圖1. DM-seq流程[1]
DM-seq流程解析：
① 末修加A：待測模板片段化及末修加A；
② 接頭連接：DNA片段與耐受胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3A）脫氨基作用的接頭（含5pyC）連接。常規甲基化接頭含有5mC，很容易通過酶脫胺轉化為T，因此需要對接頭進行修飾（5pyC接頭），防止被A3A脫氨；
③ 合成互補鏈：使用Bst DNA Polymerase合成有利于DNA羧甲基轉移酶（CxMTase）活性的半甲基化互補鏈。半甲基化CpG的存在可提高DNA的羧甲基化效率；
④ 羧甲基化：CxMTase以CxSAM為底物產生5-羧甲基胞嘧啶(5cxmC)保護所有未修飾的C；
⑤ 葡糖基化：β-葡糖基轉移酶的葡糖基化作用將5hmC變為5ghmC，保護所有5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)；
⑥⑦單鏈去除：綠豆核酸酶降解未復制的鏈（特異性降解單鏈）；
⑧ 脫氨：A3A脫氨酶僅作用于未受保護的5mC，產生T；
⑨ 測序：5mC測序結果顯示為T。
想要直接檢測5mC需要滿足兩個要求：保護基團有效轉移至未修飾的CpG；保護新生成的修飾堿基免受A3A介導的脫氨作用。CxMTase以carboxy-S-adenosyl-l-methionine（CxSAM）為底物生成的5cxmC可以抵抗酶促脫氨。使非甲基化C在轉化的過程保持為C，最終實現5mC的直接測序。
圖2. 抵抗酶促脫氨修飾堿基篩選
DM-Seq對5mC的直接檢測能夠更好地推動表觀遺傳測序在癌癥治療中的應用，但其中核心酶原料CxMTase無商業化產品，限制了其進一步的發展應用。翌圣緊跟科研前沿，借助翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor（點擊了解更多）酶改造及發酵、純化工藝平臺成為DNA羧甲基轉移酶（CxMTase，14555ES）商業化產品供應商，并可提供DM-seq全套酶原料，助力新技術研發及轉化。
翌圣CxMTase性能展示
低投入量即可高效完成DNA甲基化：
使用CxMTase對含有HpaII酶切位點的DNA模板進行甲基化修飾，該酶切位點受CpG甲基化影響，未修飾模板被切割，甲基化模板不切割；
酶切結果表明在CxMTase投入量為0.31 pmol時，模板DNA未發生切割，酶切阻斷，表明模板已被甲基化修飾。
圖3. CxMTase甲基化效率檢測 C1：DNA模板+HpaII；C2：DNA模板+水
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產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 |
末修加A | T4 DNA Polymerase | 12901ES |
T4 Polynucleotide kinase | 12902ES | |
接頭連接 | Hieff® Quick T4 DNA Ligase | 10301ES |
互補鏈擴增 | Hieff® Bst Plus DNA Polymerase | 14402ES |
葡糖基化 | T4 Phage β-glucosyltransferase (T4-BGT) | 14551ES |
羧甲基化 | CpG-Specific Carboxymethyltransferase | 14555ES |
脫氨 | Recombinant APOBEC3A (A3A) Protein | 14553ES |
