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DNA甲基化(5mC)可在腫瘤發生的早期被檢測到,具有較好的穩定性,是腫瘤液體活檢中一個價值的標志物。DNA甲基化檢測首先要進行甲基轉化,常見的分析方法是使用化學品或酶,以不同的方式與甲基化修飾的C及未修飾的C發生反應,從而將兩者區分開。目前有兩種策略,一種是通過將非甲基化的C轉化為U,如重亞硫酸氫鹽轉化法(BS-Seq)、EM-seq等;另一種是將甲基化的C轉化為U,如TAPS等。
表1. 轉化技術對比
技術 | 優勢 | 缺點 |
BS-seq | 轉化效率高,可達到99%以上 | 模板損傷大;高投入量、低有效數據量;覆蓋率低;堿基不平衡 |
EM-seq | 模板損傷少;覆蓋率高 | 轉化率低;堿基不平衡 |
TAPS | 模板損傷少;正向轉化,堿基平衡 | 脫氨基過程中產生的DHU堿基在PCR擴增過程中可能會產生一定的偏好 |
傳統的BS-seq被認為是甲基化分析的金標準,但存在明顯的限制:對DNA損傷大,影響模板利用率;非甲基化C轉化為T,基因組堿基不平衡;難以區分5mC和5hmC(另一種重要的甲基化類型,區分5mC和5hmC水平具有重要的臨床意義)。最近開發的酶學檢測技術解決了DNA損傷的問題,但還存在一定局限性,如DNA樣本需求量大、不能區分5mC和5hmC等。
為解決上述檢測問題,美國賓夕法尼亞大學研究團隊在Nature Chemical Biology上發表了題為“Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution"的文章。其開發了一種DNA甲基化測序新方法:直接甲基化測序(DM-Seq)。DM-Seq可保持基因組堿基平衡:轉化過程中,非甲基化C與5hmC不變,5mC轉化為T;使用酶法處理:靈敏度高,不損害樣本;少量DNA樣本就可以在單堿基分辨率下對5mC進行分析,有望應用于液體活檢和早期癌癥檢測等。
圖1. DM-seq流程[1]
DM-seq流程解析:
① 末修加A:待測模板片段化及末修加A;
② 接頭連接:DNA片段與耐受胞嘧啶脫氨酶(APOBEC3A)脫氨基作用的接頭(含5pyC)連接。常規甲基化接頭含有5mC,很容易通過酶脫胺轉化為T,因此需要對接頭進行修飾(5pyC接頭),防止被A3A脫氨;
③ 合成互補鏈:使用Bst DNA Polymerase合成有利于DNA羧甲基轉移酶(CxMTase)活性的半甲基化互補鏈。半甲基化CpG的存在可提高DNA的羧甲基化效率;
④ 羧甲基化:CxMTase以CxSAM為底物產生5-羧甲基胞嘧啶(5cxmC)保護所有未修飾的C;
⑤ 葡糖基化:β-葡糖基轉移酶的葡糖基化作用將5hmC變為5ghmC,保護所有5-羥甲基胞嘧啶(5hmC);
⑥⑦單鏈去除:綠豆核酸酶降解未復制的鏈(特異性降解單鏈);
⑧ 脫氨:A3A脫氨酶僅作用于未受保護的5mC,產生T;
⑨ 測序:5mC測序結果顯示為T。
想要直接檢測5mC需要滿足兩個要求:保護基團有效轉移至未修飾的CpG;保護新生成的修飾堿基免受A3A介導的脫氨作用。CxMTase以carboxy-S-adenosyl-l-methionine(CxSAM)為底物生成的5cxmC可以抵抗酶促脫氨。使非甲基化C在轉化的過程保持為C,最終實現5mC的直接測序。
圖2. 抵抗酶促脫氨修飾堿基篩選
DM-Seq對5mC的直接檢測能夠更好地推動表觀遺傳測序在癌癥治療中的應用,但其中核心酶原料CxMTase無商業化產品,限制了其進一步的發展應用。翌圣緊跟科研前沿,借助翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor(點擊了解更多)酶改造及發酵、純化工藝平臺成為DNA羧甲基轉移酶(CxMTase,14555ES)商業化產品供應商,并可提供DM-seq全套酶原料,助力新技術研發及轉化。
翌圣CxMTase性能展示
低投入量即可高效完成DNA甲基化:
使用CxMTase對含有HpaII酶切位點的DNA模板進行甲基化修飾,該酶切位點受CpG甲基化影響,未修飾模板被切割,甲基化模板不切割;
酶切結果表明在CxMTase投入量為0.31 pmol時,模板DNA未發生切割,酶切阻斷,表明模板已被甲基化修飾。
圖3. CxMTase甲基化效率檢測 C1:DNA模板+HpaII;C2:DNA模板+水
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末修加A | T4 DNA Polymerase | 12901ES |
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接頭連接 | Hieff® Quick T4 DNA Ligase | 10301ES |
互補鏈擴增 | Hieff® Bst Plus DNA Polymerase | 14402ES |
葡糖基化 | T4 Phage β-glucosyltransferase (T4-BGT) | 14551ES |
羧甲基化 | CpG-Specific Carboxymethyltransferase | 14555ES |
脫氨 | Recombinant APOBEC3A (A3A) Protein | 14553ES |