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漲知識 | 克隆專題五：分子克隆轉(zhuǎn)化方法
2023-11-15 閱讀(354)
克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應用泛的技術(shù)為“分子克隆"，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟。其中，轉(zhuǎn)化是分子克隆的關(guān)鍵步驟，其目的是產(chǎn)生重組DNA質(zhì)粒的多個拷貝。接下來小翌就具體解析一下重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細胞的過程，為您的實驗提供好方法。
轉(zhuǎn)化是細菌細胞低頻率吸收外界DNA的自然過程，在分子生物學實驗中，用于在專門為吸收DNA而制備的“感受態(tài)"細菌內(nèi)增殖質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)化過程中，質(zhì)粒DNA被引入到適當?shù)木曛?，以便菌株可以復制目標序列，用于后續(xù)進一步的分析或操作。轉(zhuǎn)化通常包括化學轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化法。
化學轉(zhuǎn)化是分子克隆實驗中的方法。該方法在1970年由Mandel和Hige發(fā)現(xiàn)，研究表明大腸桿菌細胞經(jīng)CaCl2溶液處理時能夠吸收λ噬菌體DNA。原理是利用理化方法誘導細胞，改變細胞膜狀態(tài)，增強細胞膜的通透性，細胞膜表面性狀發(fā)生暫時性改變，方便外源基因或者載體進入受體細胞，這種處于最適攝取和容納外來DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞（competent cell）。感受態(tài)細胞是基因克隆和蛋白表達所的工具。市面上就能提供可實現(xiàn)高效、可靠轉(zhuǎn)染的感受態(tài)細胞。
①質(zhì)粒DNA進入細胞；
②細胞恢復；
③細胞接種培養(yǎng)。
可根據(jù)下游應用的不同，選擇不同的感受態(tài)細胞，如表1所示，常見的有翌圣DH5α化學感受態(tài)（Cat#11802ES）、化學感受態(tài)（Cat#11801ES）、BL21(DE3)化學感受態(tài)（Cat#11804ES）、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)等。
表1.感受態(tài)菌株的選擇
菌株 | 特點 | 用途 |
DH5α | 一種常用于質(zhì)?？寺〉木?。缺失核酸內(nèi)切酶（endA），提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；重組酶缺陷型（recA）減少插入片段的同源重組率，保證了插入DNA的穩(wěn)定性；lacZΔM15的存在使得DH5α可用于藍白斑篩選。 | 構(gòu)建克隆， 質(zhì)粒提取， 藍白斑篩選 |
| 生長速度快（比DH5α快），10小時可見克隆，recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。 | 構(gòu)建克隆， 質(zhì)粒提取， 藍白斑篩選 |
BL21(DE3) | 用于以T7 RNA聚合酶為表達系統(tǒng)的高效蛋白表達宿主，可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX、pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達。 | 非毒性蛋白的表達 |
翌圣利用改良的生產(chǎn)菌株，采用嚴格的生產(chǎn)工藝，制備了高效、穩(wěn)定、適用性廣的高效感受態(tài)細胞，其批次間穩(wěn)定性強，轉(zhuǎn)化效率高（＞108 cfu/μg），無雜菌污染，無抗性偏好。廣泛適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳，適用于藍白斑篩選。
圖1. 翌圣、DH5α和BL21三種感受態(tài)不同批次的轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定
為了加快感受態(tài)轉(zhuǎn)化的流程，市面上也有應運而生的快速感受態(tài)，如翌圣F DH5α化學感受態(tài)（Cat#11803ES），與傳統(tǒng)的感受態(tài)相比，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化時間短，僅需10 min就能完成轉(zhuǎn)化過程，省去了熱激、復蘇等步驟，更加高效快速。
電擊法是通過電脈沖迅速打開細胞膜上按觸外界的通道，引導外源基因轉(zhuǎn)入細胞中，即通過施加電流來改變物質(zhì)化學性質(zhì)的方法。將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解于受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產(chǎn)生細小的縫隙，此時DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進入受體細胞。電擊法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細胞等。電擊法的優(yōu)勢是操作簡單，成本低廉，沒有基因毒性，但需要電擊杯、電轉(zhuǎn)儀器，且存在轉(zhuǎn)化效率低的問題。除了通用的轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒DNA還能通過其他方法轉(zhuǎn)化至細胞中，包括PEG法轉(zhuǎn)化、根癌農(nóng)桿菌介導法等。
PEG介導法為高國楠，該方法是通過PEG（細胞融合劑）將外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中。PEG（Cat#60304ES）作為細胞融合劑，可通過引起細胞膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，從而有利于細胞間融合和外源DNA分子進入原生質(zhì)體。碳酸鈣可與DNA結(jié)合形成DNA-碳酸鈣復合物而被原生質(zhì)體攝入。PEG法的優(yōu)勢在于其操作簡單，但存在原生質(zhì)體制備限制、轉(zhuǎn)化效率低的問題。
根癌農(nóng)桿菌介導法（ATMT）是通過根癌農(nóng)桿菌侵染細胞，將其攜帶的T DNA質(zhì)粒插入細胞中。研宄表明根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率受到啟動子、受體材料、根癌農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間等因素的影響。轉(zhuǎn)化技術(shù)往往對儀器設備要求高，操作復雜，轉(zhuǎn)化效率低。根癌農(nóng)桿菌介導法具有可選擇的受體材料范圍廣，對儀器設備要求低，轉(zhuǎn)化效率高，操作簡單等特點。翌圣乙酰丁香酮（Cat#60326ES）能誘導根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒攜帶的VirA基因的活化和高效表達，從而啟動其他Vir基因表達，切割下質(zhì)粒上的一段T-DNA單鏈，促進其轉(zhuǎn)化和整合入寄主植物基因組內(nèi)。目前普遍應用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化研究中。通過轉(zhuǎn)化反應，重組DNA質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化至宿主細胞中，接下來就來到了分子克隆的最后一步——陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。即把要轉(zhuǎn)化的細胞置于含有適量抗生素的瓊脂板上，通過藍白斑或其它方法篩選含有所需質(zhì)粒及插入片段的菌落。那么篩選步驟中應用到的技術(shù)和試劑又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解篩選技術(shù)，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 規(guī)格 |
快速感受態(tài)細胞 | DH5α Fast Chemically Competent Cell F DH5α化學感受態(tài) | 11803ES80 | 10×100 μL |
常規(guī)感受態(tài)細胞 | 0 Chemically Competent Cell 0化學感受態(tài)細胞 | 11801ES80 | 10×100 μL |
常規(guī)感受態(tài)細胞 | DH5α Chemically Competent Cell DH5α 化學感受態(tài)細胞 | 11802ES80 | 10×100 μL |
常規(guī)感受態(tài)細胞 | BL21(DE3) Chemically Competent Cell BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞 | 11804ES80 | 10×100 μL |
