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漲知識(shí) | 克隆專題五：分子克隆轉(zhuǎn)化方法

2023-11-15　　閱讀(353)

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克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆"，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。

 

大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟。其中，轉(zhuǎn)化是分子克隆的關(guān)鍵步驟，其目的是產(chǎn)生重組DNA質(zhì)粒的多個(gè)拷貝。接下來小翌就具體解析一下重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞的過程，為您的實(shí)驗(yàn)提供好方法。

 

轉(zhuǎn)化是細(xì)菌細(xì)胞低頻率吸收外界DNA的自然過程，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，用于在專門為吸收DNA而制備的“感受態(tài)"細(xì)菌內(nèi)增殖質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)化過程中，質(zhì)粒DNA被引入到適當(dāng)?shù)木曛校员憔昕梢詮?fù)制目標(biāo)序列，用于后續(xù)進(jìn)一步的分析或操作。轉(zhuǎn)化通常包括化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化法。

 

01

化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2）

化學(xué)轉(zhuǎn)化是分子克隆實(shí)驗(yàn)中的方法。該方法在1970年由Mandel和Hige發(fā)現(xiàn)，研究表明大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)CaCl2溶液處理時(shí)能夠吸收λ噬菌體DNA。原理是利用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，改變細(xì)胞膜狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞膜表面性狀發(fā)生暫時(shí)性改變，方便外源基因或者載體進(jìn)入受體細(xì)胞，這種處于最適攝取和容納外來DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）。感受態(tài)細(xì)胞是基因克隆和蛋白表達(dá)所的工具。市面上就能提供可實(shí)現(xiàn)高效、可靠轉(zhuǎn)染的感受態(tài)細(xì)胞。

 

 
其核心步驟主要分為三步
 
 

①質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞；

②細(xì)胞恢復(fù)；

③細(xì)胞接種培養(yǎng)。

 

可根據(jù)下游應(yīng)用的不同，選擇不同的感受態(tài)細(xì)胞，如表1所示，常見的有翌圣DH5α化學(xué)感受態(tài)（Cat#11802ES）、化學(xué)感受態(tài)（Cat#11801ES）、BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)（Cat#11804ES）、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)等。

 

表1.感受態(tài)菌株的選擇

菌株

特點(diǎn)

用途

DH5α

一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株。缺失核酸內(nèi)切酶（endA），提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；重組酶缺陷型（recA）減少插入片段的同源重組率，保證了插入DNA的穩(wěn)定性；lacZΔM15的存在使得DH5α可用于藍(lán)白斑篩選。

構(gòu)建克隆，

質(zhì)粒提取，

藍(lán)白斑篩選


生長速度快（比DH5α快），10小時(shí)可見克隆，recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。

構(gòu)建克隆，

質(zhì)粒提取，

藍(lán)白斑篩選

BL21(DE3)

用于以T7 RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效蛋白表達(dá)宿主，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX、pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。

非毒性蛋白的表達(dá)

 

翌圣利用改良的生產(chǎn)菌株，采用嚴(yán)格的生產(chǎn)工藝，制備了高效、穩(wěn)定、適用性廣的高效感受態(tài)細(xì)胞，其批次間穩(wěn)定性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率高（＞108 cfu/μg），無雜菌污染，無抗性偏好。廣泛適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳，適用于藍(lán)白斑篩選。

 

圖1. 翌圣、DH5α和BL21三種感受態(tài)不同批次的轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定

 

為了加快感受態(tài)轉(zhuǎn)化的流程，市面上也有應(yīng)運(yùn)而生的快速感受態(tài)，如翌圣F DH5α化學(xué)感受態(tài)（Cat#11803ES），與傳統(tǒng)的感受態(tài)相比，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，僅需10 min就能完成轉(zhuǎn)化過程，省去了熱激、復(fù)蘇等步驟，更加高效快速。

 

圖2.感受態(tài)轉(zhuǎn)化流程

 

02

電擊法

電擊法是通過電脈沖迅速打開細(xì)胞膜上按觸外界的通道，引導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，即通過施加電流來改變物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的方法。將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解于受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時(shí)高壓電場，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時(shí)DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。電擊法常用于對(duì)磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。電擊法的優(yōu)勢是操作簡單，成本低廉，沒有基因毒性，但需要電擊杯、電轉(zhuǎn)儀器，且存在轉(zhuǎn)化效率低的問題。
 
除了通用的轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒DNA還能通過其他方法轉(zhuǎn)化至細(xì)胞中，包括PEG法轉(zhuǎn)化、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。

 

03

PEG介導(dǎo)法

PEG介導(dǎo)法為高國楠，該方法是通過PEG（細(xì)胞融合劑）將外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中。PEG（Cat#60304ES）作為細(xì)胞融合劑，可通過引起細(xì)胞膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識(shí)別，從而有利于細(xì)胞間融合和外源DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體。碳酸鈣可與DNA結(jié)合形成DNA-碳酸鈣復(fù)合物而被原生質(zhì)體攝入。PEG法的優(yōu)勢在于其操作簡單，但存在原生質(zhì)體制備限制、轉(zhuǎn)化效率低的問題。

 

04

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（ATMT）是通過根癌農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞，將其攜帶的T DNA質(zhì)粒插入細(xì)胞中。研宄表明根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率受到啟動(dòng)子、受體材料、根癌農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時(shí)間等因素的影響。轉(zhuǎn)化技術(shù)往往對(duì)儀器設(shè)備要求高，操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)化效率低。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有可選擇的受體材料范圍廣，對(duì)儀器設(shè)備要求低，轉(zhuǎn)化效率高，操作簡單等特點(diǎn)。翌圣乙酰丁香酮（Cat#60326ES）能誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒攜帶的VirA基因的活化和高效表達(dá)，從而啟動(dòng)其他Vir基因表達(dá)，切割下質(zhì)粒上的一段T-DNA單鏈，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化和整合入寄主植物基因組內(nèi)。目前普遍應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究中。
 
通過轉(zhuǎn)化反應(yīng)，重組DNA質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，接下來就來到了分子克隆的最后一步——陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。即把要轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于含有適量抗生素的瓊脂板上，通過藍(lán)白斑或其它方法篩選含有所需質(zhì)粒及插入片段的菌落。那么篩選步驟中應(yīng)用到的技術(shù)和試劑又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解篩選技術(shù)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~

 

05

相關(guān)產(chǎn)品列表

 

產(chǎn)品定位

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號(hào)

規(guī)格

快速感受態(tài)細(xì)胞

DH5α Fast Chemically Competent Cell F DH5α化學(xué)感受態(tài)

11803ES80

10×100 μL

常規(guī)感受態(tài)細(xì)胞

0 Chemically Competent Cell 0化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

11801ES80

10×100 μL

常規(guī)感受態(tài)細(xì)胞

DH5α Chemically Competent Cell DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

11802ES80

10×100 μL

常規(guī)感受態(tài)細(xì)胞

BL21(DE3) Chemically Competent Cell BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

11804ES80

10×100 μL


 


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