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基因編輯在免疫細胞治療中的應用
圖1.基因編輯技術分類[1]
可編程核酸酶主要包括鋅指核酸酶 (ZFNs) 和轉錄激活因子樣效應核酸酶 (TALENs) 以及CRISPR-Cas核酸酶，這三種編輯方式都是將目的DNA打斷后產生雙鏈斷裂（DSB），后續依賴非同源末端連接或同源定向重組的方式進行修復。ZFNs是最早用于哺乳動物細胞基因編輯的人工核酸酶，通過鋅指結構域識別DNA序列并通過Fok1的二聚體對DNA進行定點切割。ZFNs作為第一代基因編輯技術其基因修復方式多樣，對基因表達程度影響較小，但是其設計與篩選過程復雜，脫靶風險高并且細胞毒性大。TALENs作為第二代基因編輯技術，結構類似于ZFNs，其毒性較低且構建容易。然而，TALENs在尺寸上比ZFNs大，組裝更加困難。后續出現的CRISPR-Cas核酸酶的出現則開啟了新的基因編輯時代。相較于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas具有良好的柔性和高效性，可以同時敲除多個基因位點，其中以CRISPR-Cas9應用最為廣泛。CRISPR/Cas9基因編輯系統包括Cas9蛋白和單鏈向導 RNA (sgRNA)，在sgRNA的向導下通過堿基互補配對原則從而識別目的基因序列，并引導Cas9蛋白酶有效切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂損傷后修復。
BE系統主要由dCas9，sgDNA和脫氨酶組成，通過對基因組 DNA中的單核苷酸轉換以實現精確的基因校正，無需產生DSB，從而克服了核酸酶的許多限制，主要包括胞嘧啶堿基編輯器 (CBE)和腺嘌呤堿基編輯器 (ABE)。PE則進一步在BE的系統引入逆轉錄酶，將切口酶與逆轉錄酶偶聯在一起，實現單堿基的轉換，敲除以及添加等操作。堿基編輯技術具有編輯效率高、編輯損傷少等特點，但是脫氨酶的使用可能會導致癌變風險的增加，而且可能出現的脫靶效應會嚴重影響編輯效率，其可靠性有待進一步研究。
圖2.CRISPR技術在T細胞治療中的應用[2]
圖3.AAV-cpf1介導的多重基因編輯流程[5]
圖4 . FT819結構
圖5 . FT522結構
圖6.SLICE篩選平臺[8]
首先，對于基因編輯策略而言, 最大的擔憂是潛在的脫靶毒性，一旦發生脫靶，將導致非靶標基因的改變或調控元件的破壞，會造成不可逆轉的后果。盡管利用預測軟件能夠分析出潛在脫靶位點, 但是在一些非典型PAM位點或者與靶點相似度較低位點仍然有可能有脫靶現象發生。同時，全基因組測序分析對于概率極低的脫靶現象也很有可能出現假陰性的結果。近年來, 許多靈敏度的體內、體外實驗方法被開發出來例如GUIDE-Seq, CIRCLE-seq, CHANGE-Seq等以幫助檢測潛在的低頻脫靶位點。新型基因編輯系統例如PE以及BE編輯系統也逐漸應用于免疫細胞治療中。這些方法在免疫細胞治療中的合理運用將會對臨床實驗的安全性起到重要的作用。
同時以過繼性細胞治療為基礎的腫瘤免疫細胞治療，主要包括CAR-T細胞、TCR-T細胞和CAR-NK細胞治療等，均需要足夠數量的免疫細胞保證其臨床療效。目前大多數基于CRISPR/Cas技術編輯的T細胞都是通過電穿孔的方法進行轉導，但是該方法對細胞損傷較大，致使細胞的活力下降并阻礙其體外增殖。因此，其他更安全、更高效的傳遞途徑亟待探索。
1.Raguram A. et al. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. Cell. 2022 Jul 21;185(15):2806-2827.
2.Elmas E. et al. CRISPR Gene Editing of Human Primary NK and T Cells for Cancer Immunotherapy. Front Oncol. 2022 Apr 5;12:834002.
3.Stadtmauer EA. et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 2020 Feb 28;367(6481):eaba7365.
4.J. Eyquem. et al., Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection, Nature 543 (7643) (2017) 113–117.
5.Dai X. et al. One-step generation of modular CAR-T cells with AAV-Cpf1. Nat Methods. 2019 Mar;16(3):247-254.
6.Dai X. et al.. Massively parallel knock-in engineering of human T cells. Nat Biotechnol. 2023 Jan 26. doi: 10.1038/s41587-022-01639-x.
7.Zhu H. et al. Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity. Cell Stem Cell. 2020 Aug 6;27(2):224-237.
8.Shifrut E. et al.Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell. 2018 Dec 13;175(7):1958-1971.e15.
9.Wang D. et al. CRISPR Screening of CAR T Cells and Cancer Stem Cells Reveals Critical Dependencies for Cell-Based Therapies. Cancer Discov. 2021 May;11(5):1192-1211.
10.Parola C. et al. Antibody discovery and engineering by enhanced CRISPR-Cas9 integration of variable gene cassette libraries in mammalian cells. MAbs. 2019 Nov-Dec;11(8):1367-1380.
