一、引言

隨著分子生物學和臨床診斷需求的增長，實時熒光定量 PCR（qPCR）技術已廣泛應用于基因表達分析、病原體檢測、SNP 分型、轉基因作物檢測、拷貝數變異研究等領域。羅氏（Roche）LightCycler 96 系列 qPCR 儀器自面市以來，以其精確的溫控系統、靈活的通量配置及友好的軟件界面，獲得了眾多實驗室的使用認可。本文將圍繞 LightCycler 96 的設計架構、性能參數、光學檢測系統、軟件功能、典型應用場景、日常操作與維護、二手設備驗收要點以及售后服務支持等方面進行全面介紹，為科研機構、第三方檢測機構和臨床實驗室提供參考。

二、設備架構與系統組成

LightCycler 96 儀器由機箱主機、溫控模塊、光學探測單元、觸控屏控制面板和外部配件（如電源線、通信線）組成。機箱尺寸（約 45 cm × 40 cm × 33 cm）適合常規實驗臺放置；凈重約 17 kg，可滿足多點移動與固定安裝需求。

• 主機外殼：防塵金屬材料，內部設有風道冷卻系統，維持元器件工作溫度。

• 溫控模塊：采用半導體 Peltier 器件加熱與制冷，溫度反饋采樣點分布于底板與蓋板，實現多點溫度監控。

• 光學探測單元：集成 LED 激發源與光電倍增管（PMT）探測器，通過濾光片組選擇不同熒光通道。

• 控制面板：7 英寸觸摸屏，嵌入式操作系統即時顯示反應進程和曲線圖。

三、溫度控制系統

1. 溫控精度與均一性

• 溫度控制精度：± 0.1 ℃；

• 平板孔間溫差：≤ 0.3 ℃；

• 多點溫度傳感設計，實現對樣本架底板與蓋板同時監控。

2. 升降溫速率

• 標稱最大升溫速率：4.5 ℃/s；

• 標稱最大降溫速率：3.5 ℃/s；

• 支持用戶自定義斜率曲線，滿足特定擴增協議要求。

3. 保溫與預冷功能

• 儀器待機時可設定低溫預冷（4 ℃）模式，適合冷鏈需求實驗；

• 自診斷功能每次開機執行溫度校準并自動記錄校準報告。

四、光學檢測系統

1. 多通道激發與檢測

• 激發光源：四色 LED（Blue, Green, Yellow, Red），覆蓋 450–660 nm 是別；

• 檢測通道：最多可設定 5 個熒光通道，兼容 FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5、Cy3 等常用染料；

• 動態濾光片切換時間：＜ 10 ms，保證快速的多重檢測執行。

2. 探測器性能

• 光電倍增管（PMT）檢測，信噪比可達 1:800；

• 自動背景扣除功能，可有效剔除板材及封板膜自發熒光。

3. 定量范圍與線性度

• 定量檢測范圍：10^1–10^9 copies；

• 標準曲線線性回歸系數（R2）：≥ 0.995；

• 檢測限：可檢測到數拷貝水平的目標序列。

五、軟件平臺與數據分析

1. 界面布局與功能模塊

• 實驗設計向導：利用向導式界面逐步設置擴增程序、熒光通道與樣本布局；

• 實時監控面板：實時展示每孔擴增曲線及熔解曲線，支持多種縮放與對比分析；

• 模板管理：可儲存、導入、導出實驗模板，加快重復實驗設置。

2. 分析方法

• 定性分析：Ct（閾值循環數）判定、擴增曲線形態學檢查；

• 相對定量：ΔΔCt 法，支持多種內參基因設定；

• 絕對定量：利用標準品梯度曲線自動計算樣本拷貝數；

• 熔解曲線分析：可對 PCR 產物進行熔解曲線圖譜比對，檢測特異性與引物二聚體；

• 多重分型：基于不同熒光通道同時分析 SNP 位點。

3. 報告與導出

• 數據輸出格式：CSV、Excel、PDF、圖像（JPEG、PNG）；

• 自定義報告模板：支持添加實驗信息、曲線圖、統計表格與備注；

• 批量導出功能：可一次性導出多個實驗結果。

六、典型應用場景

1. 基因表達研究

• 在細胞學、發育生物學及藥物篩選研究中，通過熒光標記引物對目標基因進行精準定量；

• 可同時對多種轉錄本進行監測，適合高通量篩選。

2. 病原體檢測

• 在公共衛生和臨床診斷中，快速檢測病毒（如流感病毒、冠狀病毒）、細菌（如結核分枝桿菌）、真菌 DNA；

• 短循環時間可實現 40 min 內的初步定性結果。

3. 轉基因作物與食品安全

• 檢測樣本中常見的轉基因片段（如 35S 啟動子、NOS 終止子）；

• 在食品安全監管中，對潛在過敏原和污染物進行定量分析。

4. SNP 分型與拷貝數變異

• 使用熒光探針技術實現單堿基多態性位點的精確定性與分型；

• 拷貝數變異分析支持基因擴增或缺失檢測。

5. 微生物群落定量

• 配合特定引物組，可針對環境樣本或腸道菌群進行定量分析；

• 應用于生態學、疾病模型研究等領域。

七、儀器日常操作與維護

1. 開機與關機流程

• 開機前檢查電源與通信線連接；

• 關機時先關閉軟件，再按順序斷開電源。

2. 試劑與耗材管理

• 建議選用低漂白或無漂白板材與封板膜，減少背景信號；

• 熒光探針、引物及酶體系應儲存于 ?20 ℃，使用前室溫平衡。

3. 日常清潔

• 每次運行結束后，用無塵布或專業鏡頭紙輕拭光學窗口；

• 樣本架底板可定期用 70% 乙醇擦拭，防止樣本交叉污染。

4. 定期校準

• 溫度校準：至少每 6 個月進行一次，可通過校準板或標準試劑驗證；

• 光學校準：使用標準熒光染料或校準板檢測各通道靈敏度。

5. 故障排查

• 軟件異常：重啟軟件或主機，檢查日志文件；

• 硬件報警：參考錯誤代碼手冊，必要時聯系技術支持。

八、二手設備驗收要點

1. 外觀檢查

• 機箱是否平整，無明顯劃痕或凹陷；

• 樣本架及蓋板運動是否順暢，無卡滯。

2. 功能驗證

• 溫度響應測試：運行經典梯度 PCR 程序，記錄升降溫速率與均一性；

• 熒光檢測測試：采用標準熒光板和陰性對照，檢測信號線性度與背景水平；

• 軟件操作：創建新實驗、加載模板、執行擴增、生成并導出報告。

3. 配件完整性

• 樣本架、光學封板膜、電源線、通信線及軟件安裝盤或軟件授權文件是否齊全；

• 校準報告、使用手冊及售后合同是否隨同交付。

九、典型使用案例

• 高校分子生物學實驗室
  某大學生命科學中心購入 LightCycler 96，用于腫瘤轉錄組差異表達研究，月均運行 100 板次，結果重現性優良；

• 第三方食品檢測機構
  采用本儀器開展轉基因成分定量分析，支持 ISO17025 及 GMP 質量管理體系審核；

• 區域疾病控制中心
  在流感季節，將其用于呼吸道病原體核酸檢測，實現日均 500 例樣本篩查。

十、售后服務與技術支持

1. 質保條款

• 核心部件（溫控模塊、光學模塊）質保期 6 個月；

• 其他易損件（封板膜、密封圈）質保期 3 個月。

2. 技術培訓

• 提供儀器安裝與使用培訓，包含軟件操作與常見問題處理；

• 可根據需求安排上門培訓。

3. 遠程與現場支持

• 遠程診斷：通過專用軟件監控運行狀態并分析日志；

• 現場服務：簽署服務協議后，在 48 小時內派遣工程師（限國內主要城市）。

4. 配件與升級

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5. 十二、配件及選購建議

6. 擴展模塊

1. 梯度模塊：可選裝的梯度溫區附件，可實現不同溫度條件的平行擴增，適合引物退火溫度篩選；

2. 多孔板適配器：支持 384 孔板和 72 條管格式，滿足超高通量需求。

7. 軟件選配

1. 數據管理系統（LIMS）接口：可將實驗數據自動上傳至實驗室信息管理系統；

2. 高級統計插件：包含聚類分析、主成分分析（PCA）等功能，用于大規模數據挖掘。

8. 耗材與試劑

1. 低漂白微孔板：推薦采用無漂白或低漂白板材，減少背景熒光；

2. 光學封板膜：優選超低自發熒光專用膜，保證檢測靈敏度；

3. 熒光探針體系：羅氏探針試劑盒及多家兼容品牌試劑均可配合使用，用戶可根據預算和實驗要求選擇。

9. 選購建議

1. 實驗規模：常規實驗室建議標配 96 孔板，若短期內有大量樣本，可考慮同時采購梯度與多孔板適配器；

2. 經費預算：二手設備與全新設備在初期投入上相差顯著，結合實驗室總體預算與項目周期做綜合決策；

3. 售后服務：確認供應商提供的軟件授權、質保期與工程師響應時間；

10. 十三、進階實驗應用

11. 數字 PCR（dPCR）預實驗

1. 雖然 LightCycler 96 非數字 PCR 儀，但可用作高靈敏度預實驗平臺，對樣本進行初步擴增與 Ct 值篩選，為后續數字 PCR 定量提供參考；

12. 多重 PCR 優化

1. 通過調整熒光通道及引物濃度，實現對 3–4 個目標序列的同時檢測；

2. 借助梯度模塊優化不同引物對的退火溫度，減少非特異擴增；

13. 甲基化特異 PCR

1. 配合甲基化敏感探針，進行基因組 DNA 甲基化水平定量；

2. 可在常規 qPCR 基礎上，通過設計特異性引物實現甲基化與未甲基化序列區分；

14. miRNA 表達譜分析

1. 利用干擾性引物和熒光探針體系，對短小 RNA 片段進行擴增與定量；

2. 需要在反轉錄環節加入特定的適配器序列；

15. 十四、常見問題與解決方案

16. 問題描述	可能原因	解決方案
    Ct 值波動大，重復性差	樣本上機前溫度不均一；試劑配制不準確；板材質量低	樣本及試劑室溫平衡；使用多通道移液器；選用低漂白板與封板膜。
    擴增曲線形狀異常（平緩或遲滯）	引物設計問題；模板純度不夠；熒光探針失效	重新設計引物并做梯度退火溫度預測；純化模板或稀釋檢測；更換熒光探針。
    熔解曲線出現多峰	非特異擴增或引物二聚體	檢查熔解曲線溫度范圍；優化引物濃度與退火溫度；在擴增體系中加入 DMSO 或甘油。
    光學報警，無法讀取熒光信號	板材與膜貼合不嚴或位置偏移；光學窗口臟污	重新貼膜并校正樣本架位置；用無塵紙或鏡頭紙清潔光學窗口。
    軟件崩潰或報錯	軟件版本與操作系統不兼容；用戶文件損壞	升級至最新授權版本；備份并重新導入實驗模板；聯系技術支持獲取安裝包及補丁。
    溫度不達標或溫差超標	溫控模塊老化；散熱風扇故障	進行溫控模塊校準或更換；檢查風扇及散熱通道是否被堵塞，必要時清理或更換風扇。

17. 十五、技術參數匯總（附錄）

18. 參數類型	指標
    孔板通量	96 孔/板，支持兼容 384 孔與條管格式
    溫度控制精度	±0.1 ℃
    溫度均勻性	≤ 0.3 ℃
    最大升溫速率	4.5 ℃/s
    最大降溫速率	3.5 ℃/s
    激發光源	RGBY 四色 LED
    檢測通道	最多 5 通道（可選）
    熒光染料兼容性	FAM, HEX/VIC, ROX, Cy5, Cy3 等
    靈敏度	單拷貝級別
    線性范圍	101–10? copies
    線性回歸系數 (R2)	≥ 0.995
    觸摸屏尺寸	7 英寸
    軟件輸出格式	CSV, Excel, PDF, JPEG, PNG
    通訊接口	USB 2.0 ×2, LAN ×1
    電源要求	AC 100–240 V, 50/60 Hz
    工作環境溫度	15–30 ℃
    相對濕度	20–80%（無冷凝）
    關機功耗	＜ 5 W

19. 以上內容涵蓋了 LightCycler 96 的設計結構、性能指標、檢測系統、軟件平臺、應用領域、操作維護、配件選購、進階應用、常見問題及技術參數，幫助用戶全面了解該儀器的功能特點及使用要點。