巨噬細胞的主要功能概述

巨噬細胞是天然免疫系統特化的，存活時間長，具有吞噬作用的細胞。它們與中性粒細胞一起，是感染的第一反應者[1]。巨噬細胞參與細胞碎片和病原體的識別、吞噬和降解[2]。巨噬細胞還在向T細胞提呈抗原以及誘導其他抗原呈遞細胞表達共刺激分子等方面發揮作用，從而啟動適應性免疫反應[1]。此外，在炎癥初期，它們通過釋放細胞因子和趨化因子發揮重要作用，這些細胞因子和趨化因子反過來將其他免疫細胞募集到炎癥部位[3]。

巨噬細胞的主要功能

巨噬細胞存在于大部分組織中，因此具有不同的功能。除了能啟動對病原體的免疫反應和炎癥反應，巨噬細胞還維持組織穩態以及組織的修復和重塑發揮作用[4] [5]。不幸的是，這種功能與許多疾病有關，包括代謝和自身免疫性疾病、癌癥、感染、肥胖和纖維化[5] [6]。因此，巨噬細胞似乎在腫瘤微環境中也起著關鍵作用，特別是在基質重塑、血管生成、轉移和腫瘤進展中[5]。

巨噬細胞的發育

巨噬細胞的來源很多。駐留在組織中的巨噬細胞可以從循環單核細胞中分化出來，循環單核細胞由骨髓中的造血干細胞發育而來，也可以在胚胎發育過程中在胎肝、卵黃囊或背主動脈附近的胚胎區域生成，因此在成年期獨立于單核細胞而存在[3] [5] [6]。前一種發育是通過單核細胞在穩定狀態下或炎癥時遷移到組織中實現的，隨后分化為持續性的組織特異巨噬細胞，包括骨巨噬細胞（破骨細胞）、中樞神經系統（小膠質細胞）、結締組織（組織細胞）和肝臟（庫普弗細胞），以及肺泡巨噬細胞（噬塵細胞）、腸、脾和腹膜[7]。小膠質細胞和庫普弗細胞能夠在存在白細胞介素34 （IL-34）的情況下自我更新，IL-34表達于這些組織，并與巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）的受體結合[3]。由于它們分布和作用于多種不同組織和器官中，因此巨噬細胞具有多種形態和表型[5]。

圖 1.巨噬細胞發育。單核細胞由骨髓中的造血干細胞發育而來，并經歷幾個分化步驟。單核細胞作為常駐單核細胞或有炎癥時作為炎性單核細胞遷移到常駐組織中。遷移到組織后，分化為組織特異性巨噬細胞。從源[7]修改的圖像。

巨噬細胞是吞噬細胞

巨噬細胞是除粒細胞（嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）和樹突狀細胞（DC）之外的三種吞噬細胞類型之一。微生物一旦進入宿主并開始復制，這些吞噬細胞中的一種就會將其識別并吞噬破壞，這一過程稱為吞噬作用。大多數病原體通過呼吸系統、腸粘膜、皮膚損傷或泌尿生殖道進入宿主。由于巨噬細胞聚集在粘膜下層組織中，它們通常是第一個遇到病原體的防御細胞。當某些吞噬細胞受體（通常是病原體的碳水化合物或脂質結構）與病原體表面相互作用時，吞噬作用就開始了[3]。

在第一次相互作用后，吞噬細胞質膜將病原體包圍并內化在一個被稱為吞噬體的大膜包裹的內吞囊泡中。然后吞噬體與一個或多個溶酶體融合，形成吞噬溶酶體，溶酶體是含有抗菌肽和酶的小囊泡。溶酶體內容物被釋放到吞噬溶酶體中，吞噬溶酶體反過來經歷酸化和酶促過程，生成高活性的一氧化氮和超氧化物自由基來殺死病原體[3]。

關于吞噬細胞受體的兩個例子是Dectin-1和甘露糖受體(CD206)。兩者都是C型凝集素樣家族的成員。Dectin-1由巨噬細胞和中性粒細胞表達，并與真菌細胞壁中常見的葡萄糖聚合物結合。CD206由巨噬細胞和DC表達，并與真菌、細菌和病毒共有的多種甘露糖基化配體結合[3]。

圖 2.吞噬作用。第一組：組織巨噬細胞攜帶多種表面受體，其中一些是吞噬作用所必需的。甘露糖受體可識別細菌、真菌和病毒上的甘露糖基化配體。Dectin-1與真菌細胞壁上的某些葡萄糖聚合物結合。補體受體結合并內化補體包裹的細菌。大多數吞噬作用受體可識別病原體特異性的碳水化合物或脂質結構。第二組：吞噬作用發生后，吞噬體與一個或多個溶酶體融合，生成吞噬溶酶體。

巨噬細胞分類與分型

巨噬細胞的分類仍然是一個非常有爭議的話題，不同的因素會導致不同的表型和巨噬細胞活化狀態，包括信號分子、生長因子、轉錄因子、表觀遺傳和轉錄后機制和變化，以及小生境信號，如細胞因子、細胞間接觸物和代謝物[5] [8] [9]。此外，面對微生物及其產物，如脂多糖（LPS）[10]，巨噬細胞可以調節自身的活化狀態。然而，巨噬細胞的活化在組織穩態以及炎癥和疾病進展中起著至關重要的作用[5]。一般來說，巨噬細胞可以根據其功能和活化作用進行分類，并分為兩種亞型：經典活化的M1巨噬細胞和替代活化的M2巨噬細胞。

圖 3.M1和M2巨噬細胞的分化。M1和M2巨噬細胞響應多種因素，包括信號分子、生長因子、轉錄因子、細胞因子、細胞間接觸物和代謝物。

典型活化態的M1巨噬細胞

M1巨噬細胞主要通過天然和適應性免疫反應在Th1細胞募集、病原體抵抗和腫瘤控制中發揮作用[13]。M1巨噬細胞通常由病原體、LPS、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和1型輔助性T （Th1）細胞因子干擾素γ（IFN-γ）活化。許多通路能促進巨噬細胞向M1極化，，包括IRF/STAT、LPS/TLR4和NF-κB/PI-3激酶通路[14]。

從特征上說，M1巨噬細胞抗原呈遞活性強和分泌促炎細胞因子多，如白細胞介素1 （IL-1）、IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS） [12]。此外，它們下調IL-12和IL-23和IL-10的表達[13] [5]。M1巨噬細胞的刺激導致 IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌水平提高。此外，M1巨噬細胞表型表達高水平的主要組織相容性復合體II類（MHC II）、CD68、CD80和CD86，以及針對Th1細胞的趨化因子，包括CXCL9和CXCL12 [12]。

表 1.人M1巨噬細胞標志物。這些標志物可用于區分M1巨噬細胞和其他細胞類型。

表 2.小鼠M1巨噬細胞標志物。這些標志物可用于區分M1巨噬細胞和其他細胞類型。

替代活化型M2巨噬細胞

M2巨噬細胞可由寄生蟲或真菌感染、免疫復合物、凋亡細胞、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型輔助性T細胞因子 （Th2）IL-4、IL-33和IL-25通過Th2細胞替代活化[12] [15]。促進巨噬細胞進入M2狀態的潛在信號包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ [11]。

與經典活化亞型相反，替代活化的亞型表達相反的表達譜：下調IL-12和IL-23，上調IL-10和IL-1RA [13] [5]。此外，M2巨噬細胞表達較低的炎癥細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬細胞在病原體清除、抗炎反應和代謝以及傷口愈合、組織重塑、免疫調節、腫瘤進展和惡性腫瘤中發揮作用[12] [15]。

M2表型的特點是表達CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般來說，這種亞型高效表達吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受體，以及能通過精氨酸酶通路增加鳥氨酸和多聚氨基酸的產生[12]。這種類型的巨噬細胞表達的趨化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24 [11]。

M2巨噬細胞亞型

針對巨噬細胞不同的刺激，已知有四種M2亞型：M2a、M2b、M2c和M2d。這些亞型因其細胞表面標志物、分泌的細胞因子和生物功能不同而各不相同。然而，所有M2巨噬細胞亞型都共同表達IL-10[11]。

l M2a巨噬細胞：由IL-4或IL-13活化。IL-4反過來促進甘露糖受體（CD206）的表達。經證實，進一步上調 IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18和CCL22能促進細胞生長、組織修復和胞吞作用[11]。

l M2b巨噬細胞：由免疫復合物、Toll樣受體（TLR）配體和IL-1b活化。活化后，這種亞型釋放促炎和抗炎細胞因子TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-10。M2b巨噬細胞在免疫反應和炎癥的調節中發揮作用[11]。

l M2c巨噬細胞：由糖皮質激素、IL-10和TGF-b（和滅活的巨噬細胞）活化。這種亞型的特征是高效表達抗炎IL-10、促纖維化因子TGF-b、CCL16、CCL18以及Mer受體酪氨酸激酶（MerTK）[16]，其中MerTK能促進凋亡細胞吞噬。

l M2d巨噬細胞：由TLR拮抗劑、IL-6和腺苷活化。腺苷促進IL-10和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，這個過程能加劇血管生成和腫瘤進展[11] [16]。

表 3.人M2巨噬細胞標志物。這些標志物可用于區分M2巨噬細胞和其他類型的細胞。

表 4.小鼠M2巨噬細胞標志物。這些標志物可用于區分M2巨噬細胞和其他類型的細胞。

疾病中的巨噬細胞

作為免疫系統的一部分，巨噬細胞除了在對抗疾病中發揮調節作用之外，在慢性炎癥、自身免疫性疾病和癌癥中也發揮負向作用。在常規免疫反應中，促炎巨噬細胞受到抑制，致使其促炎信號減弱。在長期損傷過程中，失調的巨噬細胞持續分泌炎性細胞因子并且募集其他免疫細胞。這些過程維持慢性炎癥，被認為在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。一旦腫瘤形成，就會使巨噬細胞從免疫活性狀態分化為免疫抑制狀態。在大多數癌癥中，這些所謂的腫瘤相關巨噬細胞（TAM）高度密集，均與患者預后不良有關。在傷口愈合過程中，如果免疫反應控制不夠，巨噬細胞也可能導致纖維化。對于其他慢性病包括動脈粥樣硬化、哮喘、炎性腸病和類風濕性關節炎[6]，巨噬細胞也起關鍵作用。

巨噬細胞研究方法

可以從全血（PBMC分離、巨噬細胞分析、單核細胞分化成巨噬細胞）或組織或腫瘤（組織或腫瘤樣本的單細胞懸液制劑）中分離和分析巨噬細胞。此外，人和小鼠單核細胞系有商業化的產品，包括THP-1細胞（急性單核細胞白血病）、U937細胞（組織細胞淋巴瘤）以及RAW264.7細胞（小鼠白血病單核巨噬細胞）和J774A.1細胞（小鼠BALB/c單核巨噬細胞）[17]。

有多種方法可以分離巨噬細胞，包括磁珠細胞分選、密度梯度分離、激光捕獲顯微解剖和流式細胞儀分選法（FACS） [18]。分離后，可以通過基因表達分析、功能研究、細胞因子和趨化因子生成的評估以及使用免疫熒光染色、免疫檢定、流式細胞儀、免疫印跡或聚合酶鏈反應的蛋白質表達和細胞表面標志物來分析和表征巨噬細胞功能和表型。請注意，并非每種分析方法均需要分離巨噬細胞[18]。

巨噬細胞分離

當分析或處理來自組織或腫瘤的巨噬細胞時，通常制備組織或腫瘤切片或單細胞懸液。組織或腫瘤切片可直接用于免疫組織化學（IHC）染色和分析。為了制備單細胞懸液，需要解剖組織或腫瘤，然后進行酶消化。單細胞懸浮液可以直接用于表面標記物的流式細胞術分析等方法

當需要時，可以使用激光捕獲顯微解剖和流式細胞儀分選法（FACS）或磁珠細胞分選試劑盒分離巨噬細胞。通過流式細胞術(FACS)進行分離時，使用針對細胞表面標記的熒光染料偶聯的抗體對細胞亞群進行染色，然后使用細胞分選儀根據定義的分選標準對染色細胞進行分選。使用抗體磁珠細胞分離試劑時，細胞特異性表面標志物的特異性抗體接合在磁珠上，細胞懸液會繼續帶有磁珠一起孵育。一旦磁珠上抗體與目標細胞的表面標志物結合，再洗去未結合的非目標細胞，就可得到與磁珠結合的目標細胞

此外，可以進一步培養和刺激分離的巨噬細胞。通常，M1巨噬細胞可以通過刺激被重新編程為M2巨噬細胞，反之亦然。巨噬細胞的培養可用于刺激或生成細胞裂解物或細胞培養上清液，其可用于qPCR檢測、免疫印跡或各種免疫檢測（IA），包括ELISA、基于磁珠的免疫檢測（如Invitrogen ProcataPlex多因子試劑盒）和基于PCR的免疫檢測（如Invitrogen ProQuantum高靈敏度免疫檢測，用于各種細胞因子的定量）。也可以通過檢測吞噬作用來研究巨噬細胞功能[17]。

當從全血中分析或處理巨噬細胞時，常用步驟是分離單核細胞并且將其分化為巨噬細胞。因此，使用Ficoll Paque通過密度梯度分離從全血中分離PBMC。這種方法利用了全血中不同細胞類型之間的密度差異。隨后，使用FACS流式分選或磁珠細胞分選試劑盒從PBMC懸液中分離CD14+單核細胞，例如，采用InvitrogenInvitrogen Dynabeads Untouched Human Monocytes Kit（類別編號11350D）、InvitrogenInvitrogen DynabeadsCD14（類別編號11149D），或InvitrogenInvitrogen DynabeadsFlowComp人CD14試劑盒（類別編號11367D）。另一種經濟高效的分離方法是在組織培養塑料器皿中培養PBMC懸浮液，單核細胞優先粘附在其上;使用明膠涂層表面會增加單核細胞數量。

巨噬細胞體外分化

有多種刺激/分化技術能在體外獲得原代巨噬細胞或極化M1或M2巨噬細胞。如果不需要進一步分離單核細胞，則分離的PBMC可通過與含15%胎牛血清（FCS）的Gibco RPMI 1640培養基一起培養直接生成巨噬細胞。

分離的單核細胞可以使用特殊的分化培養基分化成原代巨噬細胞。例如，使用生長因子GM-CSF和M-CSF可以使單核細胞分化成巨噬細胞。可以在RPMI 1640培養基中刺激單核細胞，培養基中添加10% FCS和10ng/mL GM-CSF（Gibco GM-CSF重組人蛋白，貨號PHC2013）或10ng/mL M-CSF（Gibco M-CSF重組人蛋白，貨號PHC9501）持續7天，能導致M1和M2巨噬細胞分化。刺激后，細胞以細長形狀粘附于培養皿表面。

另外，可以用不同的細胞因子先后刺激單核細胞來獲得M1和M2極化巨噬細胞。用含10% FCS的RPMI 1640培養基培養得到的細胞，隨后用10ng/mL脂多糖處理24小時（Invitrogen eBioscience脂多糖（LPS）溶液， 貨號00-4976-03）和50ng/mL IFN-γ（Gibco IFN-γ重組人蛋白，貨號 PHC4031）以獲得M1巨噬細胞或添加20ng/mL IL-4（Gibco IL4重組人蛋白，貨號PHC0041）可獲得M2/M2a巨噬細胞。用免疫復合物和IL-1b或LPS處理能促進M2b活化，加入IL-10、TGF-b或糖皮質激素則能促進M2c活化 [14] [19] [20]。可以使用免疫組織化學染色或流式細胞儀分析其表面表達的標志物來識別巨噬細胞類型（表5）。

巨噬細胞的識別和表征

表5列出了可用于識別巨噬細胞（一般表型）及其表征（功能特征）的標志物。標記物的位置(表面或細胞內)對檢測這些抗原的方法有影響。

表 5.近期已知的細胞標記物列表。列出的標志物可用于區分人和小鼠巨噬細胞。

流式細胞儀-識別巨噬細胞的示例

雖然傳統的M1/M2模型可以用于體外培養和刺激，來探索不同類型的巨噬細胞活化狀態，但對組織巨噬細胞復雜網絡的新認識清楚地表明，其無法充分描述這些細胞在體內的功能和表型多樣性[21] [22]。 因此，我們建議基于多種標志物的表達和功能特征，采用更靈活和更全面的方法來代替過分簡化的M1/M2模型。然而，用于定義M1和M2表型的經典標志物仍然在巨噬細胞表征中發揮重要作用。在這里，我們定義了一些傳統的標志物，包括誘導型一氧化氮合酶（iNOS，NOS2）、精氨酸酶-1（Arg1）、甘露糖受體（CD206）、RELM-a（FIX1）和CD163，用于表征巨噬細胞。

iNOS和精氨酸酶1

巨噬細胞（至少在小鼠細胞中）經典激活型和替代活化型的標志物分別為iNOS和Arg1（圖4）。iNOS是一種酶，可催化L-精氨酸的NADPH依賴性氧化反應生成L-瓜氨酸和一氧化氮（NO）。一氧化氮是細胞毒性和其他生理功能（例如，血管舒張）的重要介質。iNOS在巨噬細胞中不是組成型表達，其存在能表明此前用促炎細胞因子（如IL-1、TNF-α或IFN-γ）刺激的結果。

Arg1酶將L-精氨酸轉化為尿素和L-鳥氨酸。通過降解精氨酸，Arg1占據了iNOS的底物，并且下調一氧化氮生成。IL-4和IL-13強烈誘導巨噬細胞表達Arg1，而不是由抗炎細胞因子（如IL-10或TGF-b）誘導。與iNOS表達相反，在多個組織巨噬細胞群中發現Arg1有表達。例如，大多數小鼠大腹膜巨噬細胞（F4/80 高巨噬細胞）在穩態下呈Arg1陽性。如圖4所示，甚至可以在一些受IFN-γ刺激的巨噬細胞中檢測到Arg1。因此，Arg1不應被視為M2極化的特異性標記，尤其是分析原代未培養細胞時。

圖 4.用IFN-γ刺激的巨噬細胞主要表達iNOS，小部分亞群表達iNOS和低水平的Arg1。IL-4刺激的巨噬細胞表達Arg1而不表達iNOS。C57BL/6小鼠骨髓衍生巨噬細胞采用LPS和IFN-γ（M1）或IL-4（M2a）處理24小時，隨后用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號48-4801-82）進行表面染色。然后用nvitrogen eBioscience Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer SetI（貨號88-8824-00）固定和透化細胞，隨后用Invitrogen iNOS單克隆抗體（克隆CXNFT）、APC（貨號17-5920-82）和Invitrogen精氨酸酶1單克隆抗體（克隆A1exF5）、PE（貨號12-3697-82）進行細胞內染色。存活F4/80+細胞用于分析。

甘露糖受體（CD206）

巨噬細胞甘露糖受體，稱為CD206或甘露糖受體C類型1（MRC1），介導真菌、細菌、原生動物和病毒抗原的吞噬和內吞攝取，并且在免疫防御及其調節中發揮重要作用。甘露糖受體是替代活化巨噬細胞的原始識別標志物。與Arg1相反，CD206廣泛地在替代活化型巨噬細胞中表達，包括用IL-10或糖皮質激素處理的耐受性細胞。有趣的是，TGF-b被證明可以下調CD206的表達。抑制這種受體表達的其他因素包括LPS、IFN-γ和TNF-α。與Arg1相似，CD206組成型表達于多種類型的組織巨噬細胞中，盡管它與Arg1的表達模式不重疊。圖5中的右組顯示了CD206在小（F4/80 lo）和大（F4/80 hi）腹膜巨噬細胞中的組成性表達。

圖5.大量小鼠小腹膜巨噬細胞（F4/80 lo）和大腹膜巨噬細胞（F4/80 hi）的組成性表達CD206。用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號48-4801-82）對小鼠常駐腹膜滲出細胞進行表面染色，隨后用Invitrogen eBioscience Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set（貨號88-8824-00）進行固定和透化。然后用Invitrogen大鼠IgG2b同種型對照（克隆eB149/10H5）、APC （貨號17-4031-82（左組）或Invitrogen CD206單克隆抗體（克隆MR6F3）、APC（貨號17-2061-80（右組）對細胞進行胞內染色。總細胞用于分析；大多數雙陰性細胞為B細胞。

RELM-a（FIZZ1）

RELM-a，也稱為抵抗素樣α或FIZZ1，是一種由IL-4和IL-13強烈誘導的小細胞因子，參與抵抗寄生蟲感染的反應。與Arg1相似，糖皮質激素和IL-10不能誘導RELM-a。盡管如此，這兩種常用的M2活化標志物的在體內表達的模式非常不同。例如，在沒有刺激的情況下，大多數小腹膜巨噬細胞（F4/80 lo）和少數大腹膜巨噬細胞（F4/80 hi）表達RELM-a（圖6）。

圖6.大多數小腹膜巨噬細胞（F4/80 lo）和極少數大腹膜巨噬細胞（F4/80 hi）自發表達RELM-a。C57BL/6小鼠常駐腹膜滲出細胞用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號48-4801-82）進行表面染色。然后用Invitrogen eBioscience Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set（貨號88-8824-00）固定和透化細胞，并且用Invitrogen大鼠IgG1同種型對照（克隆eBRG1）、APC（貨號17-4301-82（左組）或Invitrogen RELMα單克隆抗體（克隆DS8RELM）、APC（貨號17-5441-82）（右組）對細胞進行胞內染色。所有腹膜細胞用于分析；大多數雙陰性細胞為B細胞。

CD163

CD163為觸珠蛋白和血紅蛋白受體。由于CD163的主要功能是促進鐵的再循環過程，因此在脾紅髓巨噬細胞中可以觀察到CD163的最高表達。CD163還可以用于檢測某些細菌化合物，并且在組織巨噬細胞的其他亞群中表達，包括Kupffer c細胞、腸固有層巨噬細胞和一部分大腹膜巨噬細胞（圖7），盡管表達程度較低。與人CD163不同，小鼠CD163不容易由M2極化細胞因子誘導，故不是鼠科動物M2巨噬細胞的良好標志物。相反，其表達似乎表明了組織特異性巨噬細胞功能（例如，血紅蛋白再循環）

圖7.很大一部分大腹膜巨噬細胞（F4/80 hi）和幾乎沒有小腹膜巨噬細胞（F4/80 lo）組成性表達CD163。BALB/c小鼠脾細胞用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號48-4801-82）和Invitrogen大鼠IgG2a同種型對照（克隆eBR2a）、PerCP-eFluor 710（類別編號46-4321-82）（左組）或Invitrogen CD163單克隆抗體（克隆TNKUPJ）、PE（貨號12-1631-82)（右組）對細胞進行胞內染色。總細胞用于分析。

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