Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness

Keywords: Atg7; Osx1-Cre; Sod2; osteocytes; tibia compressive loading.

運動引起的機械負荷，特別是負重沖擊，通過刺激成骨細胞（分泌骨基質的細胞）促進骨形成來增加骨量。成骨細胞數量和骨形成的減少是人類和小鼠隨著年齡增長而骨量流失的主要因素。衰老機制，如活性氧（ROS）過量或自噬減少，與老化骨骼中骨形成減少有關。骨骼中線粒體（mt）ROS 隨著年齡的增長而增加，它們在間充質譜系細胞（包括成骨細胞前體、成骨細胞和骨細胞）中的衰減抵消了老齡小鼠骨量的損失。線粒體呼吸過程中產生的線粒體 ROS 受到涉及超氧化物歧化酶2（Sod2）的抗氧化防御機制的對抗。與 mtROS 對骨骼衰老影響的貢獻一致，成骨細胞系細胞中 Sod2 的缺失會降低骨形成和骨量。

自噬，通過回收細胞內成分（如錯誤折疊的蛋白質或受損的細胞器）來維持細胞功能和體內平衡。在使用牙本質基質蛋白1（Dmp1）-、Osterix 1（Osx1）- 和 I 型膠原α 1（Col1a1）-Cre 靶向細胞的成骨細胞譜系中，缺失必要的自噬相關基因，如Atg7、Atg5 和 RB1CC1，證明了自噬對骨形成的作用。自噬隨著年齡的增長而變得不那么有效，并可能導致老齡小鼠的骨形成減少。機械力，如壓縮應力和流體剪切應力，已被證明可以增強骨細胞和成骨細胞培養物中的自噬通量。

盡管有證據支持過量的 mtROS 或自噬的降低導致衰老過程中成骨細胞生成和骨量減少，但這些機制是否會特異性影響骨機械反應性仍是未知數。最近，美國阿肯色大學醫學院內分泌和代謝學系、生理學和細胞生物學系及肌肉骨骼疾病研究中心的一項實驗檢查了成骨細胞系細胞中自噬減少或 mtROS 增加是否會損害機械刺激下的成骨反應。研究成果發表于 Aging 期刊題為“Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness”。

首先，比較了幼齡（6 個月）和老齡（21 個月）雌性 C57BL/6J 小鼠對機械刺激的反應，對小鼠左脛骨施加軸向壓縮負荷（4 Hz，-7.8 N / -6.6 N），右脛骨用作對照。Micro-CT分析顯示，在中軸或距脛腓遠端連接處近5毫米處，負荷對幼齡和老齡小鼠的皮質厚度沒有顯著影響。由于礦化表面和礦物質附著率的增加，通過鈣黃綠素-茜素雙重標記測量的骨形成率在 6 個月大的小鼠外（骨膜）負荷的脛骨表面增加。在 21 個月大小鼠的負荷脛骨中也檢測到這些成骨作用，然而，老齡小鼠負荷誘導的骨形成率的幅度顯著降低。

此外，還研究了超過骨骼在正常日常活動中經歷的更高程度的壓力如何影響老齡小鼠的機械反應性，即對6 月齡和 21 月齡雌性 C57BL/6J 小鼠的左脛骨分別加載 -10N 和 -8.5N 的壓縮負荷。由于骨膜周長增加，兩周的負荷增加了幼齡小鼠負荷脛骨中軸和近端部位的皮質厚度，而在骨內膜表面沒有發現影響（圖1 A、B）。老齡老鼠的負荷也引起了類似的效果，然而，顯微 CT 觀察到老齡小鼠在其負荷的脛骨中形成了編織骨。這種現象通常發生在骨骼損傷的反應，例如微骨折。組織形態學分析證實了不規則編織骨的形成，尤其是在骨膜表面（圖1 C）。這些結果表明，衰老會降低骨膜對機械刺激的成骨反應，與年輕骨骼相比，衰老骨骼響應增加的機械需求而形成新骨骼的能力大大減弱。

圖1    較高的機械應變導致老齡小鼠骨膜編織骨形成。

接下來，研究了 Sod2 缺失引起的過量 mtROS 是否會損害響應機械負荷的成骨反應，在成骨細胞系細胞中生成 Sod2 缺失小鼠（Sod2^ΔOsx1）。定量 RT-PCR 分析證實，Sod2^ΔOsx1 小鼠骨髓來源的成骨細胞培養物中 Sod2 mRNA 表達水平降低，且Sod2 的減少增加了 mtROS 水平。

然后，將 12 月齡的雌性 Sod2^ΔOsx1 小鼠及其 Osx1-Cre 對照小鼠的左脛骨以 -8.5N 加載兩周，發現負荷增加脛骨近端和中軸的皮質厚度。一致地，在骨髓面積、總面積、皮質面積、極性慣性矩或脛骨中軸的物質密度方面，沒有觀察到基因型相關的差異。Sod2^ΔOsx1 和 Osx1-Cre 小鼠在負荷的脛骨骨膜和骨內膜表面增加的骨形成率、礦化表面和礦物質附著率沒有區別（圖2 A-C）。這些結果表明，成骨細胞系細胞中 mtROS 的增加不足以影響骨合成代謝對機械刺激的反應。

圖2    成骨細胞譜系中過量的線粒體 ROS 不會影響負荷誘導的骨形成。

最后，為了驗證成骨細胞中的自噬減少是否可能解釋衰老過程中負荷誘導的骨形成降低，構建 Atg7^ΔOsx1 小鼠。為了確認自噬的抑制，使用免疫印跡分析測量了成骨細胞培養物中 LC3 和 p62 的水平（圖3 A）。LC3-I 到 LC3-II 的轉化通常用作自噬水平的指標。p62 是一種經典的自噬底物，將細胞內自噬物質運輸到自噬體進行降解，p62水平升高通常被認為是自噬活性受到抑制的標志。結果表明，表達Osx1-Cre的細胞中Atg7的缺失抑制了自噬體的形成，從而抑制了自噬，如LC3轉化和p62積累減少所示（圖3 A）。

之前已經表明，Atg7 的缺失會大大降低皮質骨中的樹突連接。據推測，骨細胞網絡的退化會損害骨合成代謝對負荷的反應。因此，評估了骨細胞突起的密度，這是骨細胞嵌入骨基質時形成的（圖3 B）。與 Osx1-Cre 對照相比，Atg7^ΔOsx1 小鼠的平均熒光強度歸一化到骨區域，指示骨細胞突起的數量和大小顯著降低（圖3 C）。這些發現證實，成骨細胞譜系中 Atg7 的缺失會破壞骨細胞網絡的形成或維持。此外，Atg7^ΔOsx1 小鼠的骨細胞體比對照組大（圖3 C），這可能是由于細胞質成分的積累，這些成分通常在從成骨細胞轉變為骨細胞的過程中被降解。

進一步地，分別用 -7.3 N 和 -7.6N 加載 10 月齡的雌性 Atg7ΔOsx1 小鼠和 Osx1-Cre 對照小鼠的左脛骨。兩周的負荷增加了 Atg7ΔOsx1 小鼠和 Osx1-Cre 小鼠脛骨中軸和近端的皮質厚度。在髓質面積、總面積、極慣性矩或負荷脛骨中軸的物質密度方面，沒有觀察到基因型相關的差異。此外，在 Atg7ΔOsx1 和 Osx1-Cre 小鼠中，負荷增加了骨膜和骨內膜表面的骨形成率、礦化表面和礦物質附著率，其程度相似。這些結果表明，成骨細胞系細胞中自噬的減少不足以改變機械刺激下的成骨反應。

圖3    成骨細胞系細胞中的 Atg7 缺失會破壞骨細胞網絡。

總之，該研究表明，成骨細胞中 mtROS 的增加或 Atg7-依賴性自噬的減少，以及骨細胞樹突數量減少——骨骼老化的常見特征——不會導致衰老過程中的機械反應性降低。在肌肉中，與低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平相關的線粒體代謝改變與老年人身體活動的反應降低有關。對老齡小鼠施用 NAD + 前體可減輕骨量的損失。刺激 NAD+ 是否也能促進骨骼機械反應性需要未來進一步研究。

參考文獻：Resende-Coelho A, Ali MM, James A, Warren A, Gatrell L, Kadhim I, Fu Q, Xiong J, Onal M, Almeida M. Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness. Aging (Albany NY). 2025 Mar 18;17(3):610-629. doi: 10.18632/aging.206213. Epub 2025 Mar 18. PMID: 40105873; PMCID: PMC11984430.

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