一、背景

血液增菌培養(yǎng)基用于血液、胸、腹水等無(wú)菌液體標(biāo)本需氧菌的增菌實(shí)驗(yàn)時(shí)使用，滿足各種需氧菌的培養(yǎng)需求。

原理：該培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分豐富，加入指示劑，在無(wú)菌的情況下顯紅色，有菌生長(zhǎng)的情況下為黃色，如有產(chǎn)鹼細(xì)菌生長(zhǎng)顯深紅色。

成分(g/L)：蛋白胨10.0；牛肉浸出粉3.0；氯化鈉5.0；葡萄糖3.0；枸櫞酸鈉3.0；對(duì)氨基苯甲酸0.05；硫酸鎂2.4；酚紅0.024；pH值7.4±0.1，25℃。

用法：稱取本品26.5g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝每瓶50-100ml,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、集標(biāo)本和接種

接種前仔細(xì)檢查培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)是否被污染（由紅變黃）。黑色血紅蛋白顆粒屬正常。

打開(kāi)瓶上的鋁蓋進(jìn)行嚴(yán)格消毒，無(wú)菌采集標(biāo)本5-10ml，直接用針頭穿入橡膠塞中心部位入瓶?jī)?nèi)，加入標(biāo)本（不可將注射器中空氣注入瓶?jī)?nèi)），取出針頭再次消毒瓶塞。

輕搖培養(yǎng)瓶使液體充分混勻。然后在瓶上寫(xiě)好病人的姓名、接種日期等。

2、培養(yǎng)

將培養(yǎng)瓶放入35-37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

以后每天取出觀察，看瓶中液體是否變色。

3、結(jié)果判讀

一周內(nèi)任何時(shí)間發(fā)現(xiàn)有培養(yǎng)基變色；血液層上有絮狀沉淀；血液層表面或深層有白色顆粒；液體培養(yǎng)基凝固等細(xì)菌生長(zhǎng)跡象，應(yīng)立即做菌種的分離鑒定及初步藥敏分析。

三、應(yīng)用

用于動(dòng)物性食品中四種致病菌多重PCR快速檢測(cè)方法研究：

目前對(duì)食品中致病菌檢測(cè)的方法以微生物常規(guī)培養(yǎng)法為主,需要37天,操作繁瑣,所用試劑復(fù)雜多樣,費(fèi)用很高,不能滿足實(shí)際商品流通需要。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn),使用PCR技術(shù)檢測(cè)食品中致病菌的研究方興未艾。大腸埃希氏菌O157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和熒光假單胞菌是污染動(dòng)物性食品的四種重要的致病菌。

結(jié)合通用前增菌技術(shù)研究,建立了一種多重PCR檢測(cè)新方法,可以在LB培養(yǎng)基通用增菌后的6h內(nèi)一步同時(shí)檢測(cè)食品中污染的這四種致病菌。該方法具有特異性良好、簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。研究結(jié)果如下:（1）對(duì)大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、單增李氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、熒光假單胞菌等九種食源性致病菌進(jìn)行通用前增菌方法研究,實(shí)驗(yàn)表明,在LB肉湯培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)18 h,增菌,且增菌數(shù)量級(jí)均衡一致,達(dá)108 cfu/mL。

（2） LB、NB和UPB培養(yǎng)基中30℃、33℃、36℃培養(yǎng)12h,大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、單增李氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、熒光假單胞菌等九種菌增菌數(shù)量級(jí)達(dá)到106以上,也能夠滿足PCR等檢測(cè)方法的需要。但這幾種培養(yǎng)基在36℃的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)選在1218 h左右,不宜超過(guò)18 h。

（3） 根據(jù)大腸埃希氏菌O157:H7的eaeA基因,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的hly基因,小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的ail基因,熒光假單胞菌的htpX基因設(shè)計(jì)了4對(duì)引物。實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有良好的特異性。

（4）建立了大腸埃希氏菌O157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和熒光假單胞菌的單重和多重PCR檢測(cè)方法,并確定了多重PCR體系和熱循環(huán)參數(shù)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了所建立的方法特異性很強(qiáng)。

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