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在表觀遺傳學研究中，DNA甲基化作為基因表達調控的核心機制之一，其檢測技術的精準度直接影響科研與臨床診斷的可靠性。當前主流的甲基化轉化技術可劃分為三大類：基于化學處理的亞硫酸氫鹽轉化、反向酶法轉化EM-seq以及正向酶法轉化TAPS。本文將從原理、流程、優缺點及前沿進展等維度，系統解析這三種技術的核心差異與應用場景。
亞硫酸氫鹽轉化
經典技術的劍
技術原理與流程
亞硫酸氫鹽轉化（Bisulfite Conversion）是DNA甲基化檢測的“金標準”，其核心原理是通過亞硫酸氫鈉（NaHSO?）在酸性條件下對DNA進行化學修飾：未甲基化的胞嘧啶（C）被脫氨基轉化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不變。后續通過PCR擴增將U轉化為胸腺嘧啶（T），最終通過測序比對C/T比例確定甲基化狀態。
典型流程
5 min-150 min轉化；(翌圣生物推出5 min超快速轉化試劑盒，極速轉化)；
30 min脫硫和洗滌；
5 min洗脫核酸。
技術優勢與局限性
優 勢
高靈敏度：轉化效率可達99.5%以上，適用于微量樣本（如cfDNA）。
成熟度高：自1992年應用以來，技術流程已高度標準化。
局限性
DNA損傷嚴重：亞硫酸氫鹽處理會導致DNA鏈斷裂，片段長度通常縮短至100-1000 bp，會丟失部分基因組信息。
堿基失衡：轉化后GC含量降低，導致測序數據中AT占比過高，可能掩蓋真實甲基化信號。
應用場景
腫瘤標志物檢測：如肺癌中APC、RASSF1A基因啟動子高甲基化。
發育生物學研究：追蹤胚胎干細胞分化過程中的甲基化重塑。
反向酶法轉化EM-seq
溫和高效的新選擇
技術原理與流程
EM-seq（Enzymatic Methyl-sequencing）是一種基于酶促反應的甲基化轉化技術，其核心流程包括：
DNA甲基化保護
使用TET酶保護所有未修飾的C；
葡糖基化酶保護5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。
非甲基化C脫氨
APOBEC脫氨酶將未甲基化的C轉化為U；
甲基化的C（5mC）和羥甲基化的C（5hmC）被特異性保護。
技術優勢與局限性
優 勢
DNA損傷小：可保留10 kb以上的長片段DNA，適用于全基因組甲基化圖譜繪制。
兼容性強：可與多種下游分析技術（如甲基化特異性PCR、質譜）結合。
局限性
成本較高：酶原料價格昂貴。
技術成熟度低：酶的穩定性弱于化學法。
應用場景
全基因組甲基化測序：分析復雜疾病（如神經退行性疾病）的甲基化調控網絡。
單細胞甲基化研究：結合單細胞測序技術，解析細胞異質性。
腫瘤早篩：需要高靈敏度、低損傷的腫瘤早篩或液體活檢項目。
正向酶法轉化TAPS
精準區分甲基化修飾
技術原理與流程
TAPS（TET-assisted Pyridine Borane Sequencing）是一種基于氧化酶和化學還原的甲基化轉化技術，其核心流程包括：
TET酶氧化
TET酶將5mC和5hmC氧化為5-羧基胞嘧啶（5caC）；
未甲基化的C不受影響。
化學還原
吡啶peng烷將5caC還原為二氫尿嘧啶（DHU），后續PCR擴增中DHU轉化為T。
技術優勢與局限性
優 勢
流程簡化：酶法氧化+化學還原，減少操作步驟。
只轉化5mC和5hmC：能保留基因組原來的信息。
兼容性強：適配全基因組測序、單細胞甲基化分析等。
堿基平衡：酶法轉化不改變DNA的GC含量，測序數據質量更高。
局限性
轉化效率波動：受酶活性影響，批間穩定性需驗證。
應用場景有限：目前主要用于科研探索，臨床轉化較少。
轉化率偏低：轉化率≥85%。
應用場景
需要高靈敏度、低損傷的腫瘤早篩或液體活檢項目。
需要一份樣本同時檢測甲基化和基因突變信息。
技術對比與展望
方法 | 轉化效率 | DNA損傷 | 樣本需求 | 成本 | 推薦場景 |
亞硫酸氫鹽轉化 | ＞99.5% | 高 | 100 pg-2 μg | 低 | 傳統甲基化研究、高分辨率測序 |
EM-seq | ≥99% | 低 | 1-200 ng | 高 | cfDNA研究、腫瘤早篩 |
TAPS | ≥85% | 低 | 1-100 ng | 高 | cfDNA研究、腫瘤早篩 |
展 望
1. 多組學整合：將甲基化數據與轉錄組、蛋白質組數據結合，解析表觀遺傳調控網絡。
2. 自動化與微型化：開發便攜式甲基化檢測設備，推動床旁診斷（POCT）應用。
探索表觀遺傳學的奧秘，翌圣生物提供全面的解決方案。我們精心研發的甲基化轉化試劑和甲基化建庫試劑，確保您在研究DNA甲基化模式時的精確性和可靠性。此外，翌圣的ATAC-seq和CUT-Tag技術，為解析復雜基因調控網絡提供了強有力的工具。無論是基礎研究還是臨床應用，翌圣的表觀遺傳學原料都是您科研路上的堅實伙伴。
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