一、背景

大鼠氣管上皮細胞是一種在實驗室研究中常用的細胞類型。這些細胞通常來自大鼠的氣管組織，并被培養在實驗室中以研究各種生理和病理過程。

在近端下呼吸道的上皮表面，主要是纖毛上皮細胞，它與基底細胞及杯狀細胞一起構成假復層上皮，到達氣管腔。

這些細胞可以用于各種實驗，例如藥物篩選、毒理學測試、免疫學研究等。然而，需要注意的是，這些細胞是經過人工培養的，可能存在一些與天然組織不同的特性。

二、大鼠氣管上皮細胞培養操作

1)復蘇大鼠氣管上皮細胞：以下細胞培養凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)大鼠氣管上皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

a、棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養基的新皿中或者瓶中，置于培養箱中培養。

3)大鼠氣管上皮細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應用

大鼠氣管上皮細胞可以用于苯并（a）芘對大鼠氣管—支氣管上皮細胞p16、RASSF1A基因甲基化的影響：

觀察不同濃度的苯并(a)芘在不同時間對原代培養的大鼠氣管上皮細胞p16、RASSF1A基因啟動子區甲基化程度的影響。

方法：

(1)采用組織塊培養法培養原代大鼠氣管上皮細胞；

(2)噻唑蘭(MTT)還原實驗檢測系列苯并(a)芘濃度和不同作用時間對原代大鼠氣管上皮細胞增殖活性的影響；

(3)應用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)檢測不同濃度的苯并(a)芘對原代大鼠氣管上皮細胞p16、RASSF1A基因啟動子區甲基化程度的影響。

結果：

(1)在本實驗室成功建立了用組織塊培養法培養原代大鼠氣管上皮細胞的方法；

(2)MTT實驗結果顯示苯并(a)芘濃度在10.0μmol/L及以下時，72h內大鼠氣管上皮細胞抑制率均小于50%，具有明顯的抑制增殖作用，并呈劑量依賴性；

(3)以0.1、1.0、10μmol/L的苯并(a)芘分別處理原代大鼠氣管上皮細胞24h、48h、72h后，發現p16和RASSF1A基因啟動子區均未發生甲基化，并通過測序驗證。

結論：

(1)組織塊培養法是培養原代大鼠氣管-支氣管上皮細胞的較好方法，方法簡便，易操作；

(2)苯并(a)芘對大鼠氣管-支氣管上皮細胞的毒性隨著苯并(a)芘濃度的增大而增大，具有明顯的抑制增殖作用，并呈劑量依賴性；

(3)0.1、1.0、10μmol/L的苯并(a)芘對原代大鼠氣管-支氣管上皮細胞分別作用24h、48h、72h，不會引起p16、RASSF1A基因啟動子區甲基化。

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