ProteanFect CRISPR Ultra 轉染試劑盒產品詳解

產品簡介

ProteanFect CRISPR Ultra 轉染試劑盒是ProteanFect系列中專為難轉細胞系基因編輯而設計的創新產品。該試劑盒基于自組裝蛋白納米顆粒技術，作為一種非病毒、非電轉、非脂質體的轉染試劑，能夠高效且安全地將基因編輯工具RNP（包含Cas9蛋白和guide RNA）遞送至細胞內，從而實現高效的基因編輯。

儲存與成分

運輸與儲存?：ProteanFect CRISPR Ultra 轉染試劑盒采用干冰運輸，收到后應立即存放于-80℃直至使用。

試劑盒規格?：依據Reagent B的體積設定。

試劑盒組分及存儲?：

Reagent A（PT07）：使用后保存于2-8℃。

Reagent B（PT07）：保存于-20℃，避免反復凍融。

Cas9 protein（1 µg/µL）：保存于-80℃，避免反復凍融。

EGFP mRNA（1 µg/µL）：陽性對照，保存于-80℃，避免反復凍融。

Human TRAC-sgRNA（1 µg/µL）：陽性對照，靶向序列為TGTGCTAGACATGAGGTCTA，保存于-80℃，避免反復凍融。

實驗前準備

待轉染細胞?：細胞必須處于良好的生長狀態，活率＞90%。

推薦培養基?：Opti-MEM培養基（或無血清的RPMI 1640培養基/無血清DMEM培養基），提前預熱至室溫。

轉染試劑?：室溫自然解凍，顛倒或渦旋至溶液均一后使用。

其他材料?：完·全培養基、無菌EP管、所需轉染的核酸樣品。

操作步驟（以96孔板體系為例）

配置ProteanFect轉染體系?：

在40 µL Reagent A（PT07）中加入0.8 µg（約5 pmol）Cas9 protein和0.3 µg（約10 pmol）sgRNA，充分混勻。

加入1.4 µL Reagent B（PT07），移液槍上下吹打20-30次或渦旋10秒，使其充分混勻。配置完成后置于冰上保存；如需在室溫下保存，須在30分鐘內使用完畢。

細胞處理?：

懸浮細胞?：取待轉染細胞，300g離心5分鐘，棄去上清后以Opti-MEM重懸細胞沉淀，再次離心，最終用Opti-MEM重懸并調整細胞濃度至5×10? - 1×10? cells/mL備用。

貼壁細胞?：轉染前匯合率保持在50%-80%，棄去培養基后，用Opti-MEM輕柔清洗細胞兩次，并加入20 µL Opti-MEM備用。

細胞轉染?：

將配置好的ProteanFect轉染體系與20 µL細胞懸液混合后，在離心管中孵育（或直接加入貼壁細胞中）。

37℃培養箱孵育45-60分鐘（孵育時間可根據不同細胞類型進行適當調整）。

加入約5倍轉染體系體積的完·全培養基，300g離心5分鐘，棄去上清（貼壁細胞可直接棄去混合液并補加培養基）。

細胞培養與觀察?：

加入適量完·全培養基，進行細胞培養，72小時后可對靶點進行編輯效率分析。

轉染不同規格孔板的使用含量

以下提供了不同規格孔板轉染時的各組分使用含量：

孔板類型Reagent A（PT07）Cas9 protein/sgRNAReagent B（PT07）推薦每孔細胞數（Opti-MEM）

96孔40 µL0.8 µg/0.3 µg1.4 µL1×10^5~2×10^5（20 µL）

48孔80 µL1.6 µg/0.6 µg2.8 µL2×10^5~4×10^5（40 µL）

24孔200 µL4 µg/1.5 µg7 µL4×10^5~1×10^6（100 µL）

12孔600 µL7.5 µg/4.5 µg21 µL1×10^6~3×10^6（300 µL）

6孔800 µL16 µg/6 µg28 µL2×10^6~4×10^6（400 µL）

數據分享

使用ProteanFect CRISPR Ultra轉染試劑盒轉染Jurkat細胞，并使用試劑盒中的Human TRAC-sgRNA陽性對照敲除TRAC基因。轉染72小時后，收集細胞DNA水平檢測基因敲除效率。結果顯示，陽性對照組中靶點基因被編輯的比例約為63.4%，平均編輯效率約為63.9%。

常見問題解答

如何提升轉染效率?？

根據細胞類型和培養條件優化轉染條件。

適當延長轉染時間（通常細胞系不超過2小時）。

適當增加轉染體系至初始的1.5-2.5倍。

細胞系轉染前處理?？

使用活性超過90%的細胞。

不建議使用傳代次數超過15次的細胞。

新復蘇的細胞需傳代2-3次后使用。

關于EGFP mRNA陽性對照的使用?？

首·次嘗試時，建議設置陽性對照組（EGFP mRNA），以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用96孔板的細胞量即可，節省細胞和試劑。

RNP的投入量如何確定?？

Cas9蛋白和sgRNA的摩爾比推薦在1：1-1：2.5之間。

以96孔細胞量的轉染體系為例，Cas9蛋白的投入量在0.8 µg-1.6 µg。

轉染后的細胞處理?？

轉染后，細胞狀態可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進行轉染時，對細胞活力的損傷較小。通常在轉染后第二天，細胞狀態會基本恢復。

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