圖 1. FBP1 和 P53 在人類 HCC 中表達下調。

在 83 例 HCC 中，71% 的病例中 FBP1 表達下調，并且與 ALDOB 丟失、AKT 激活、MDM2 Ser166 (AKT 位點) 磷酸化升高以及 p53、p21^CIP1 和 p16^INK4a 表達下降顯著相關 (圖 1a)。在 HCC 中，FBP1 廣泛下調 (圖 1b)。低 FBP1 和 ALDOB 表達與較差的生存率相關 (圖 1c)。甲基化組分析顯示，與正常肝細胞核相比，HCC 細胞核中 FBP1 啟動子區域的高甲基化水平，而 TP53 啟動子的甲基化未見改變 (圖 1d)。TP53 缺失降低了小鼠肝臟、致癌物誘導的 HCC、人類肝細胞以及 TP53 野生型 HCC 細胞系 HepG2 和 SK-Hep-1 中 FBP1 的 mRNA 和蛋白水平 (圖 1e)。

圖 2. DNA 損傷誘導的 FBP1 和 p53 在 MASH 中的上調。

喂食易感 MASH 的 MUP-uPA 小鼠高果糖飲食 (HFrD)，而非等熱量的玉米淀粉飲食 (CSD)，誘導了 p53、p21^CIP1、p16^INK4a 和 FBP1 的表達，并抑制了 AKT 激活 (圖 2a)。肝細胞 DNA 損傷及其 DNA 損傷反應 (DDR) 介質升高，同時觀察到 P-RPA2 和衰老相關的 β-半乳糖苷酶表達升高 (圖 2b)。HFrD 飼喂誘導了早期癌前病變，這些病變中聚泛素化蛋白聚集體和自噬伴侶蛋白 p62 的積累提示自噬受損，NRF2 (NQO1)、CD44 和 MYC 被激活，而 p53 和 FBP1 表達下調 (圖 2c)。晚期人類 MASH 蛋白質組和組織的分析證實了 FBP1、ALDOB、p53、p21^CIP1、p16^INK4a 和 DDR 的上調，以及 AKT 和 NRF2 活性的降低 (圖 2d)。FBP1 的缺失增加了 HcPC 的數量，而 HcPC 比未聚集的肝細胞表現出更多的 DNA 損傷，同時伴隨著 DDR 和 DNMT1 的上調、AKT 和 NRF2 的激活，以及 FBP1、p53、p21^CIP1 和 p16^INK4a 的下調 (圖 2e)。單核 RNA 測序表明 FBP1 缺失增加了疾病相關肝細胞的數量，同時減少了 3 區肝細胞 (圖 2f)。WB 結果表明 FBP1 缺失緩解了 HFrD 誘導的 AKT 抑制，增強了 GSK3β Ser9 和 MDM2 Ser166 的磷酸化、DDR 標志物的表達，并下調了 p53 和 p21^CIP1 (圖 2g)。

圖 3. FBP1 或 p53 缺失以及 AKT 激活促進 NRAS^G12V 腫瘤發生。

NRAS^G12V 在 Fbp1^F/F 小鼠中幾乎不具腫瘤形成能力，但在 Fbp1^ΔHep 小鼠中，它迅速誘導輕度纖維化的 HCC，這些腫瘤陽性表達 α-胎蛋白 (AFP)、CD44 和 MYC (圖 3a, b)。與 NRF2 激活一致，p53 和 p21 表達下調 (圖 3c)。肝細胞 Trp53 缺失同樣支持了快速的 NRAS^G12V 誘導的 HCC，同時下調 FBP1 并增強 AKT 和 NRF2 的激活 (圖 3d)。在 Fbp1^F/F 和 Fbp1^ΔHep 小鼠肝臟中轉導了 AAV8-Ctrl、AAV8-FBP1 和 AAV8-FBP1(E98A)，兩者均顯著減少了腫瘤數量和體積 (圖 3e)。AKT 抑制劑 (AKTi) 和 nutlin-3a 也阻止了 NRAS^G12V 誘導的 HCC，nutlin-3a 不影響 AKT 或 NRF2，而 AKTi 阻斷了 NRF2 的激活、AKT 和 GSK3β 的磷酸化以及 MDM2 的磷酸化，同時恢復了 p53 和 p21^CIP1 的表達 (圖 3f–h)。

圖 4. NRF2 誘導的 FBP1 降解緩解衰老以激發腫瘤形成。

HCC 細胞中 FBP1 缺失激活了 NRF2 (圖 4a)。在 Nrf2^Act-Hep 小鼠中特異性表達 NRF2 (E79Q) 會下調 FBP1 和 p53 (圖 4b)。ATG7 缺失通過 p62 積累激活 NRF2 并增強 HCC 發展，這導致了更為顯著的 FBP1 下調 (圖 4c)。HCC 細胞中表達 NRF2 (E79Q) 加速了 FBP1 的周轉 (圖 4d)，FBP1 有兩個潛在的 ERK 磷酸化受體，包括 Ser271，其中用丙氨酸替換可阻止 ERK 誘導的磷酸化及其與 FBP1 相關的泛素連接酶 TRIM28 的招募 (圖 4e)。ERK2 沉默可阻止 TRIM28 誘導的 FBP1 泛素化，而磷酸模擬突變 S271D 則增強了這一過程 (圖 4f)。FBP1 低表達的人類 HCC 還顯示出 NRF2、NQO1 和 ERK 磷酸化的上調 (圖 4g)。

圖 5. NRF2 和 FBP1 逆向影響肝細胞轉錄組。

Nrf2^Act-Hep 與 Nrf2^Tg/Tg、Fbp1^ΔHep 與 Fbp1^F/F 肝臟重疊上調基因的基因本體生物學過程 (GO BP) 富集分析結果 (圖 5a)。Nrf2^Act-Hep 與 Nrf2^Tg/Tg 和 Fbp1^ΔHep 與 Fbp1^F/F 肝臟重疊下調基因的基因本體生物學過程富集分析 (圖 5b)。對照或 NRAS^G12V 流體動力學尾靜脈注射 (HTVI) 1 周后 Nrf2^Tg/Tg 和 Nrf2^Act-Hep 肝臟細胞衰老 mRNA 的熱圖數據 (圖 5c，d)。CPTAC-LIHC 數據中 FBP1 蛋白的細胞衰老 (CS) (上) 和細胞周期 (下) 評分。(圖 5e)。

圖 6. 突變特征和 HCC 從 DNA 損傷和衰老前驅細胞中出現的過程。

基于 hfrd 誘導的 MUP-uPA Fbp1^ΔHep HCC 的三核苷酸的突變頻率特征 (圖 6a)。NRAS^G12V 誘導的 Nrf2^Act-Hep HCC 的突變頻率特征 (圖 6b)。冷凍 mT/mG 肝臟切片 DAPI 染色結果 (圖 6c)。