Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡/周期檢測試劑盒工作原理詳解
試劑盒組成及作用
Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡/周期檢測試劑盒主要包含 Annexin V-FITC、PI 和結合緩沖液。Annexin V-FITC 是將 Annexin V 與 FITC 標記形成的復合物,PI 是一種核酸染料。結合緩沖液含有鈣離子,可為 Annexin V 與 PS 結合提供適宜環境,維持細胞狀態穩定,減少非特異性結合。
工作原理
細胞膜的不對稱性和 PS 的外翻
正常細胞膜的磷脂分布具有不對稱性,磷脂酰絲氨酸(PS)位于細胞膜內側。細胞凋亡時,PS 會在早期從細胞膜內側翻轉到外側,這一變化是檢測細胞凋亡的重要標志之一。
Annexin V-FITC 與 PS 的結合
Annexin V 是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白,對 PS 具有高親和力。在細胞凋亡早期,Annexin V-FITC 可與外翻至細胞膜外側的 PS 結合,從而識別早期凋亡細胞。
PI 的染色作用
PI 不能透過活細胞和早期凋亡細胞的完整細胞膜,但能透過晚期凋亡和壞死細胞的細胞膜,與細胞核中的 DNA 結合,使細胞核染色。通過 Annexin V-FITC 和 PI 的聯合染色,可以區分活細胞(Annexin V-FITC-/PI-)、早期凋亡細胞(Annexin V-FITC+/PI-)、晚期凋亡細胞(Annexin V-FITC+/PI+)和壞死細胞(Annexin V-FITC-/PI+)。
檢測方法
流式細胞術
流式細胞術是目前常用的細胞凋亡檢測方法之一,具有快速、靈敏、定量分析等優點。通過設置未染色組、PI 單染組及 Annexin V-FITC 單染組等對照,調整流式細胞儀的電壓和光補償后,可準確區分不同狀態的細胞。Annexin V-FITC 的最大激發波長為 488nm,發射波長為 525nm,在 FL1 通道檢測;PI-DNA 的最大激發波長為 535nm,發射波長為 617nm,在 FL2 或 FL3 通道檢測。
熒光顯微鏡檢測
對于懸浮細胞,可按照流式細胞術步驟操作后,將細胞懸液置于玻片上進行觀察。對于貼壁細胞,可在孔板中放置細胞爬片,待細胞貼壁后進行誘導凋亡、染色等操作,再用熒光顯微鏡進行觀察。在熒光顯微鏡下,早期凋亡細胞呈綠色熒光,壞死細胞呈紅色熒光。
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