Annexin V-AbFluor™ 405 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒工作原理詳解
細(xì)胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主有序死亡過程。在正常活細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),細(xì)胞凋亡早期,PS 會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè),暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V 是一種分子量為 35-36kDa 的鈣離子依賴型磷脂結(jié)合蛋白,能與 PS 高親和力特異性結(jié)合。Annexin V-AbFluor™ 405 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的 Annexin V 被 AbFluor™ 405 熒光染料標(biāo)記,可通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。
碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,不能透過完整細(xì)胞膜。早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜保持完整,對(duì) PI 有拒染性;但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI 能透過細(xì)胞膜,使細(xì)胞核染上紅色熒光。將 Annexin V 與 PI 匹配使用,可區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞以及凋亡中晚期或壞死細(xì)胞。
具體來(lái)說(shuō),使用 Annexin V-AbFluor™ 405 和 PI 染色細(xì)胞群后,在流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡下觀察:活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整,Annexin V-AbFluor™ 405 無(wú)法與其結(jié)合,幾乎無(wú)熒光;早期凋亡細(xì)胞的 PS 外翻,Annexin V-AbFluor™ 405 與其結(jié)合,使細(xì)胞膜呈現(xiàn)藍(lán)色熒光;凋亡中晚期或壞死細(xì)胞,細(xì)胞膜破損,PI 進(jìn)入細(xì)胞與核酸結(jié)合,使細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光,同時(shí)細(xì)胞膜上結(jié)合的 Annexin V-AbFluor™ 405 使其呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。
操作步驟
流式細(xì)胞儀分析 :
通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)培養(yǎng)無(wú)誘導(dǎo)的對(duì)照培養(yǎng)物。
4℃,300g 離心 5min 收集 1-2×10^5 細(xì)胞,用冰預(yù)冷的 PBS 洗滌兩次。貼壁細(xì)胞使用胰酶消化后離心收集細(xì)胞,需控制胰酶消化時(shí)間,避免細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷出現(xiàn)細(xì)胞壞死假陽(yáng)性。
用 100µL 1×Annexin V Binding Buffer 重懸細(xì)胞。
每 100µL 細(xì)胞懸液中加入 4-5µL Annexin V-AbFlour™ 405 和 1-2µL PI,輕柔混勻。
室溫避光孵育 15min。
孵育結(jié)束后加入 400µL 1×Annexin V Binding Buffer,輕柔混勻后置于冰上。染色后 30min 內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞,使用 404nm 和 535nm 激發(fā),431nm 和 617nm 附近測(cè)量熒光。
熒光顯微鏡分析 :
懸浮細(xì)胞 :按流式細(xì)胞分析步驟操作后,將細(xì)胞懸浮置于玻片上,用蓋玻片蓋住細(xì)胞,盡快使用適當(dāng)濾鏡通過熒光顯微鏡分析細(xì)胞。
貼壁細(xì)胞 :
細(xì)胞接種于爬片或腔室載玻片上,培養(yǎng)細(xì)胞。
通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)培養(yǎng)無(wú)誘導(dǎo)的對(duì)照培養(yǎng)物。
除去培養(yǎng)基,用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次。
準(zhǔn)備工作液:每 100µL 1×Annexin V Binding Buffer 添加 4-5µL Annexin V-AbFlour™ 405 和 1-2µL PI,輕柔混勻。最佳濃度可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求確定。
在細(xì)胞中加入適量工作液,確保工作液全部覆蓋細(xì)胞,室溫避光孵育 15-30min,也可在冰上孵育,但孵育時(shí)間需延長(zhǎng)到至少 30min。
用 1×Annexin V Binding Buffer 洗滌細(xì)胞兩次,此步不要使用 PBS 洗滌細(xì)胞。
載玻片上添加一滴 1×Annexin V Binding Buffer,然后將細(xì)胞爬片置于載玻片上,對(duì)于細(xì)胞腔室載玻片上的細(xì)胞,添加足夠 1×Annexin V Binding Buffer 覆蓋細(xì)胞,也可使用抗熒光淬滅封片劑封片。
使用適當(dāng)濾光片在熒光顯微鏡下分析細(xì)胞。
試劑盒組分及儲(chǔ)存
試劑盒包含 Annexin V Binding Buffer(5×)、Annexin V-AbFluor™ 405、Propidium Iodide(PI)。Annexin V Binding Buffer(5×)需按說(shuō)明用去離子水稀釋成 1×Annexin V Binding Buffer。Annexin V-AbFluor™ 405 和 PI 均為即用型,使用前需平衡到室溫。試劑盒在 4℃避光保存,穩(wěn)定期至少 6 個(gè)月。
技術(shù)參數(shù)
Annexin V-AbFluor™ 405 的激發(fā)波長(zhǎng) / 發(fā)射波長(zhǎng)為 404nm/431nm,PI 與 DNA 結(jié)合后的激發(fā)波長(zhǎng) / 發(fā)射波長(zhǎng)為 535nm/617nm。
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