Annexin V-AbFluor™ 405 細胞凋亡檢測試劑盒工作原理詳解
細胞凋亡是維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主有序死亡過程。在正?;罴毎?,磷脂酰絲氨酸(PS)位于細胞膜內側,細胞凋亡早期,PS 會從細胞膜內側翻轉到外側,暴露在細胞外環境中。Annexin V 是一種分子量為 35-36kDa 的鈣離子依賴型磷脂結合蛋白,能與 PS 高親和力特異性結合。Annexin V-AbFluor™ 405 細胞凋亡檢測試劑盒中的 Annexin V 被 AbFluor™ 405 熒光染料標記,可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測早期凋亡細胞。
碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,不能透過完整細胞膜。早期凋亡細胞的細胞膜保持完整,對 PI 有拒染性;但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI 能透過細胞膜,使細胞核染上紅色熒光。將 Annexin V 與 PI 匹配使用,可區分活細胞、早期凋亡細胞以及凋亡中晚期或壞死細胞。
具體來說,使用 Annexin V-AbFluor™ 405 和 PI 染色細胞群后,在流式細胞儀或熒光顯微鏡下觀察:活細胞因細胞膜完整,Annexin V-AbFluor™ 405 無法與其結合,幾乎無熒光;早期凋亡細胞的 PS 外翻,Annexin V-AbFluor™ 405 與其結合,使細胞膜呈現藍色熒光;凋亡中晚期或壞死細胞,細胞膜破損,PI 進入細胞與核酸結合,使細胞核呈現紅色熒光,同時細胞膜上結合的 Annexin V-AbFluor™ 405 使其呈現藍色熒光。
操作步驟
流式細胞儀分析 :
通過所需方法誘導細胞凋亡,同時培養無誘導的對照培養物。
4℃,300g 離心 5min 收集 1-2×10^5 細胞,用冰預冷的 PBS 洗滌兩次。貼壁細胞使用胰酶消化后離心收集細胞,需控制胰酶消化時間,避免細胞膜結構損傷出現細胞壞死假陽性。
用 100µL 1×Annexin V Binding Buffer 重懸細胞。
每 100µL 細胞懸液中加入 4-5µL Annexin V-AbFlour™ 405 和 1-2µL PI,輕柔混勻。
室溫避光孵育 15min。
孵育結束后加入 400µL 1×Annexin V Binding Buffer,輕柔混勻后置于冰上。染色后 30min 內通過流式細胞儀分析細胞,使用 404nm 和 535nm 激發,431nm 和 617nm 附近測量熒光。
熒光顯微鏡分析 :
懸浮細胞 :按流式細胞分析步驟操作后,將細胞懸浮置于玻片上,用蓋玻片蓋住細胞,盡快使用適當濾鏡通過熒光顯微鏡分析細胞。
貼壁細胞 :
細胞接種于爬片或腔室載玻片上,培養細胞。
通過所需方法誘導細胞凋亡,同時培養無誘導的對照培養物。
除去培養基,用 PBS 洗滌細胞兩次。
準備工作液:每 100µL 1×Annexin V Binding Buffer 添加 4-5µL Annexin V-AbFlour™ 405 和 1-2µL PI,輕柔混勻。最佳濃度可根據具體實驗要求確定。
在細胞中加入適量工作液,確保工作液全部覆蓋細胞,室溫避光孵育 15-30min,也可在冰上孵育,但孵育時間需延長到至少 30min。
用 1×Annexin V Binding Buffer 洗滌細胞兩次,此步不要使用 PBS 洗滌細胞。
載玻片上添加一滴 1×Annexin V Binding Buffer,然后將細胞爬片置于載玻片上,對于細胞腔室載玻片上的細胞,添加足夠 1×Annexin V Binding Buffer 覆蓋細胞,也可使用抗熒光淬滅封片劑封片。
使用適當濾光片在熒光顯微鏡下分析細胞。
試劑盒組分及儲存
試劑盒包含 Annexin V Binding Buffer(5×)、Annexin V-AbFluor™ 405、Propidium Iodide(PI)。Annexin V Binding Buffer(5×)需按說明用去離子水稀釋成 1×Annexin V Binding Buffer。Annexin V-AbFluor™ 405 和 PI 均為即用型,使用前需平衡到室溫。試劑盒在 4℃避光保存,穩定期至少 6 個月。
技術參數
Annexin V-AbFluor™ 405 的激發波長 / 發射波長為 404nm/431nm,PI 與 DNA 結合后的激發波長 / 發射波長為 535nm/617nm。
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