Q1: 如何選擇磷酸化位點檢測的最佳方法？

A1: 常規(guī)檢測推薦Western blot（WB），適用于已知位點的快速驗證。若需高通量檢測或未知位點鑒定，質(zhì)譜法（如TiO2富集結(jié)合LC-MS/MS）是shǒu xuǎn，其靈敏度可覆蓋低豐度磷酸化蛋白。酪氨酸磷酸化建議使用特異性抗體富集技術(shù)，避免傳統(tǒng)IMAC法的低特異性問題。

Q2: 如何預(yù)測磷酸化位點的上游激酶？

A2: 可以使用生物信息學(xué)工具（例如 PhosphoSitePlus 或激酶-底物富集分析 (KSEA)）預(yù)測上游激酶，這些工具可以分析已知的激酶-底物基序和信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。為了驗證預(yù)測結(jié)果，通常使用體外激酶測定或免疫共沉淀 (Co-IP) 后進行質(zhì)譜分析等實驗方法來確認激酶-底物相互作用。

Q3: 磷酸化蛋白WB出現(xiàn)非特異性條帶如何解決？

A3: 關(guān)鍵步驟包括：①使用BSA而非牛奶封閉；②加入蛋白酶/磷酸酶抑制劑；③設(shè)置總蛋白內(nèi)參（如Akt總蛋白）及體系內(nèi)參（如GAPDH）。

Q4: 磷酸化修飾是否穩(wěn)定？樣品應(yīng)如何保存以避免去磷酸化？

A4: 磷酸化修飾在體外環(huán)境下相對不穩(wěn)定，尤其容易被內(nèi)源性磷酸酶去磷酸化。建議：

●  樣品裂解時加入廣譜磷酸酶抑制劑（如NaF）；

●  處理后的蛋白或肽段應(yīng)置于-80℃保存，避免反復(fù)凍融；

●  富集后的磷酸化肽建議盡快上機分析，長期保存前可進行凍干處理。

Q5: 磷酸化蛋白質(zhì)是否一定功能活性發(fā)生變化？

A5: 不一定。盡管磷酸化是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的調(diào)控機制，但并非所有磷酸化事件都會引起蛋白功能的改變。磷酸化可以激活或抑制酶活性、調(diào)控蛋白-蛋白相互作用、改變亞細胞定位，或通過與泛素化等其他翻譯后修飾的串?dāng)_影響蛋白穩(wěn)定性。然而，某些磷酸化位點可能并不具有直接功能，僅作為“旁觀者”修飾存在。一個磷酸化事件是否具有功能意義，主要取決于其修飾殘基的具體位置及其結(jié)構(gòu)背景，并需通過生物學(xué)實驗加以驗證。

Q6: 能否只分析酪氨酸（Tyr）磷酸化，不考慮Ser/Thr？

A6: 可以。由于Tyr磷酸化在細胞中豐度極低且特異性強，常規(guī)的TiO?或IMAC富集方法對其不具備足夠的選擇性，因此建議采用磷酸化酪氨酸抗體進行免疫沉淀（IP）富集。選擇高親和力和高特異性的p-Tyr抗體對于實驗成功至關(guān)重要，同時建議準(zhǔn)備較多的起始樣本量，以獲得足夠的信號用于后續(xù)質(zhì)譜分析。

Q7: 如何提高磷酸化肽段的檢出率？

A7: 提高檢出率需關(guān)注以下兩點：

●  蛋白覆蓋度：覆蓋度越高，越有可能檢測到磷酸化位點。

●  磷酸化比例：位點磷酸化比例越高，檢出概率越大。

此外，建議使用溫和裂解條件并添加磷酸酶抑制劑（如NaF）以防止磷酸化位點丟失。

Q8: 不同的磷酸肽富集方法有哪些優(yōu)缺點？

A8: 不同的磷酸肽富集方法各有優(yōu)勢和適用場景，常見的方法主要包括金屬氧化物親和層析（TiO?）、金屬離子親和層析（IMAC）和免疫親和富集（IP）。TiO?富集法具有操作簡便、重復(fù)性好、對Ser/Thr磷酸化肽段親和力強等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于大規(guī)模磷酸化組學(xué)研究，但對Tyr磷酸化的識別效率較低，且可能共富集帶有酸性氨基酸的非磷酸化肽。IMAC方法通過Fe3?、Ga3?等離子與磷酸基團作用進行選擇性結(jié)合，選擇性與TiO?相似，但在某些體系下背景較高，需優(yōu)化洗脫緩沖體系以提高特異性。免疫親和富集使用針對磷酸化位點（尤其是p-Tyr）的特異性抗體進行識別，是研究低豐度修飾或特定通路蛋白的有效手段，具有高度特異性，但成本較高，對抗體質(zhì)量依賴性強，且不適用于大規(guī)模無偏分析。因此，磷酸肽富集方法應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康?、樣本類型及目?biāo)位點選擇，必要時也可聯(lián)合多種策略提高覆蓋率和特異性。

Q9: 磷酸化蛋白的WB實驗中，如何減少背景噪音？

A9: 減少背景噪音的方法包括：

●  選擇合適的封閉劑（如BSA）。

●  優(yōu)化抗體濃度和孵育時間。

●  增加洗膜次數(shù)和時間。

●  使用高質(zhì)量的抗體和檢測試劑。

這些措施有助于提高信噪比，獲得清晰的條帶。

Q10: 如何通過實驗驗證潛在的磷酸化位點？

A10: 潛在磷酸化位點的實驗驗證通常涉及分子和功能方法的結(jié)合。一種常見的策略是定點誘變，即用特定的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基（通常用丙氨酸）進行替換，以評估其在蛋白質(zhì)功能中的作用。此外，還可以使用針對修飾殘基的磷酸化特異性抗體進行蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀實驗，以檢測生理條件下預(yù)測位點的磷酸化情況。為了進一步驗證功能意義，可以使用細胞或生化分析來評估磷酸化或突變后蛋白質(zhì)活性、定位或結(jié)合相互作用的變化。與精選的磷酸化數(shù)據(jù)庫和先前報道的研究進行交叉引用，也可以提供背景信息，并支持該位點的生物學(xué)相關(guān)性。

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