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紫外分光光度技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)含量

閱讀:559      發(fā)布時(shí)間:2022-07-18
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一、實(shí)驗(yàn)原理

由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì),吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi),蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系,可用作定量測(cè)定。

利用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是民迅速、簡便、不消耗樣品,低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此,在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中(特別是在柱層析分離中)得到廣泛應(yīng)用。此法的缺點(diǎn)是:(1)對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì),有一定的誤差;(2)若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì),會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸的吸收高峰不同,并利用這一性質(zhì),通過計(jì)算可以適當(dāng)校正核酸的干擾作用。

二、實(shí)驗(yàn)用品

(一)器材

   (1) 752紫外分光光度計(jì)。

   (2) 移液管。

(3)試管及試管架。  


 (二)試劑

    標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:準(zhǔn)確稱量經(jīng)微量凱氏定氮法校正標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),用重蒸餾水配制成濃度為1mg/ml的溶液。


 (三)材料

        待測(cè)蛋白質(zhì)樣品溶液(用重蒸餾水適當(dāng)稀釋)。


三、實(shí)驗(yàn)程序

  1.標(biāo)準(zhǔn)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

   取8支試管,按表1-1分別向每支試管加入各種試劑,搖勻。

選用光程為1cm的石英比色杯,在280nm處分別測(cè)定各管溶液的OD280值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),OD280值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。


2.樣品測(cè)定

   取適當(dāng)濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液,同樣選用光程為1cm的石英比色杯,測(cè)定280nm處的光吸收值,并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。




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