PriCells: 動物子宮頸部上皮細胞的培養(yǎng)

實驗材料：

1. 動物子宮頸部穿刺或切除所得組織

2. 3T3成纖維細胞

3. 0.25%胰蛋白酶/EDTA

4. KCM：DMEM中添加10%FBS、0.5ug/ml氫化可de松和1×10-10mol/L霍亂毒素

5. EGF：100ugEGF溶于1ml無菌的UPW中。按100ul分裝，在-20℃條件下儲存。用10ml的含有血清的培養(yǎng)液配制100ug/mlEGF工作液，按100ul分裝，在4℃儲存。使用時，用含有血清的培養(yǎng)液稀釋（1：100）成最終濃度（10ng/ml）

6. CT：將1.18ml無菌的UPW加入1mg CT，配制成10-5mol/L CT液，在4℃儲存。將100ul 10-5mol/L CT加入10ml含血清培養(yǎng)液中，制成工作液。過濾除菌后，在4℃儲存。使用時，最終濃度為10-10mol/L

7. 氫化可de松：將1mg氫化可de松溶解于1ml 50%乙醇（v/v，用蒸餾水配制）。然后，按100ul分裝，在-20℃儲存。最終濃度為0.5ug/ml

8. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4

9. 解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷

10. 培養(yǎng)皿（直徑60mm和90mm）

11. 離心管（15ml、50ml）

12. 照射源：X射線或60Co

實驗方法：

1. Swiss 3T3 成纖維細胞的準備

（1） 準備大量的3T3細胞，按1.5×104個/cm2的細胞密度將3T3細胞接種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)。24h后換液，每2-3d換液1次，4-5d傳代。使用的細胞不超過20代。

（2） 為了避免輕度污染，將一瓶生長較好的細胞用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)。然后，在每代用這些細胞接種于該周所需要飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)瓶中。

（3） 通過60Gy X射線或60Co照射使飼養(yǎng)細胞滅活。被照射的3T3細胞在4℃條件下可存放3-4d。

（4） 在無照射源的條件下，用絲裂菌素C滅活飼養(yǎng)細胞。在37℃條件下，用400ug/ml絲裂菌素C處理單層3T3細胞1h。用胰蛋白酶消化絲裂菌素C處理過的細胞，混懸細胞，用含有血清的培養(yǎng)液洗細胞2次。然后，用*培養(yǎng)液混懸細胞，調(diào)整細胞密度。

2. 從轉運培養(yǎng)液中取出子宮頸部皮膚組織塊，用5ml含有50ug/ml硫酸慶大霉素和5ug/ml兩性霉素的無菌PBSA沖洗2-3次。將組織塊放入培養(yǎng)皿，表皮面朝下，用一次性手術刀剝除肌肉和真皮，保留薄而不透明的表皮片，用眼科剪將表皮片剪碎至1cm3大小。

3. 將剪碎的組織塊轉入無菌三角瓶內(nèi)，加入15ml預先在37℃條件下預熱的胰蛋白酶-EDTA液，將三角瓶移入恒溫水浴振蕩器內(nèi)，37℃水浴中振蕩消化45min。在室溫條件下，將細胞懸液放置2-3min。取出細胞懸液，用不銹鋼或塑料濾網(wǎng)濾入50ml離心管。然后加入10ml*培養(yǎng)液。

4. 加入15ml預熱的胰蛋白酶-EDTA液含有表皮小塊的器皿，重復消化、過濾操作步驟2-3次。收集細胞懸液，以1000r/min，離心5min，吸去上清液，加入10ml*培養(yǎng)液，充分混懸細胞。用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，然后用臺盼藍拒染法估計細胞活力。

5. 用KCM稀釋細胞懸液，將2×104個/cm2表皮細胞與1×105個/cm2致命滅活的3T3細胞同時放入培養(yǎng)皿。60mm培養(yǎng)皿，接種1×105個/cm2個表皮細胞和5×105個/cm2個被照射的3T3細胞。

6. 在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)72h后，用添加10ng/ml EGF的培養(yǎng)液換液。在顯微鏡下檢查細胞，確定加入足夠的飼養(yǎng)細胞。如有必要，再加入飼養(yǎng)細胞。每周換液2次。8-12d，在顯微鏡下可見到角質形成細胞克隆。14-16d，肉眼下見到角質形成細胞克隆，此時應進行傳代。

7. PriCells-原代上皮細胞特制基礎培養(yǎng)基。

8. PriCells-原代上皮細胞培養(yǎng)特制添加劑。

9. PriCells-原代細胞分離試劑盒。

10. PriCells-原代細胞鑒定試劑盒。