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CRISPRCas9技術科研實驗技術服務介紹

閱讀:140          發布時間:2024-9-24
CRISPRCas9技術


應用簡介
       簡單來講,CRISPR/Cas9是一種分子生物學技術,通過這種技術科研人員可以對細胞和生物體內的基因進行編輯。所謂的基因編輯就是通過某種生物手段和技術,對生物體內的遺傳物質進行修改。基于原核生物的獲得性免疫系統研發出的CRISPR/Cas9技術只包含兩種重要的成分,一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白,而另一種則是具有導向功能的sgRNA(single guide RNA)。當細胞內同時表達sgRNA和Cas9蛋白時,Cas9蛋白通過與sgRNA結合,靶向到目的DNA序列上發揮DNA雙鏈切割的功能。DNA序列被切割產生斷裂后,引發細胞內部的DNA修復機制(DNA repair)。真核細胞同時存在著同源重組修復和非同源重組修復。在同源重組修復下,斷裂的染色體以另一條完整的姐妹染色單體為模板進行DNA修復,而在非同源重組修復下,斷裂出的DNA隨機修復,引入新的堿基,使基因產生移碼突變。
技術原理
       CRISPR/Cas9系統的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通過堿基配對與 tracrRNA (trans-activating RNA) 結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物,此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點處剪切雙鏈 DNA,從而實現對基因組DNA序列進行編輯;而通過人工設計這兩種 RNA,可以改造形成具有引導作用的gRNA (guide RNA),用以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。
       靶位點的選擇要求:
       1、靶位點主要包括20 個堿基,并且這20個堿基后面是NGG的PAM 區;
       2、靶位點盡量選擇在基因編碼區的前端;
       3、轉化應選擇對應抗性的LB平板培養基。
實驗方法

技術總結
Crispr/Cas9慢病毒特點: 
1、適用于在同一個細胞系中需要進行多個基因敲除的實驗;
2、基因敲除效率比直接質粒轉染更高;
3、提供多種不同熒光和抗性標記的慢病毒表達載體,更易篩選到基因敲除成功細胞;
4、接受cas9蛋白穩定表達不同細胞系定制。
Crispr/Cas9腺病毒特點:
1、可感染多種分裂期和非分裂期細胞,感染效率高、敲除效率高;
2、操作簡單,容易掌握;
3、基因敲除周期短,成本低;
4、適合哺乳動物不同種屬不同基因的操作,適用范圍廣。
 


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