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綠色植物中葉綠素含量是測定植物所需氮含量的重要因素，是植物進行光合作用的關鍵因素，因此對植物的生理學研究也是個重要的考核指標。葉綠素測定儀通過測量葉片在兩種波長范圍內的透光系數來確定葉片當前葉綠素的相對數量,也就是在葉綠素選擇吸收特定波長光的兩個波長區域，根據葉片透射光的量來計算測量值。

葉綠素測定儀的測定原理是根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即A=αCL式中：α比例常數。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，α為該物質的吸光系數。各種有色物質溶液在不同波長下的吸光系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的吸光度而求得。

若測定葉綠體色素混合提取液中的葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數可求得其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，通常用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區的大吸收峰。