聯(lián)系電話
上海瑋馳儀器有限公司
中級(jí)會(huì)員·6年
- 聯(lián)系人：
- 蘇小姐
- 電話：
- 400-820-3556
- 手機(jī)：
- 18521301252
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)環(huán)科路999弄浦東國(guó)際人才港13號(hào)樓2樓
- 網(wǎng)址：
- www.weichilab.com
掃一掃訪問(wèn)手機(jī)商鋪
在之前的“轉(zhuǎn)染方法如何選"中，物、化、生三大類轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)缺點(diǎn)已進(jìn)行總結(jié)歸納，下面是復(fù)習(xí)時(shí)間：
電穿孔，即我們常說(shuō)的“電轉(zhuǎn)"，是實(shí)驗(yàn)室中除了病毒轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體或PEI轉(zhuǎn)染外使用較為普遍的一種物理轉(zhuǎn)染方法。
對(duì)于電轉(zhuǎn)方法的使用，有人說(shuō)它們能夠高效轉(zhuǎn)染難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如神經(jīng)元、免疫、原代細(xì)胞等，同時(shí)在現(xiàn)階段大熱的應(yīng)用中，如基因編輯、CRISPR篩選，甚至于近年來(lái)新型崛起的合成生物學(xué)和AI制藥研發(fā)中，都常能看到電轉(zhuǎn)技術(shù)的應(yīng)用。
而作為獲得今年生物技術(shù)領(lǐng)域四大的私募融資的實(shí)體瘤CAR-T明星公司Arsenal Biosciences，也是采用了非病毒載體的基因編輯CITE技術(shù)(CRISPR Integration of Transgenes by Electroporation)，即用電穿孔手段實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因CRISPR整合技術(shù)，使T細(xì)胞有選擇性地靶向腫瘤，從而使患者的免疫系統(tǒng)能夠在不破壞正常組織的情況下摧毀ccRCC細(xì)胞(clear-cell renal cell carcinoma)。
那么如何在實(shí)驗(yàn)中提高電轉(zhuǎn)效率，想必是大家最關(guān)心的問(wèn)題，那這八大注意事項(xiàng)一定能夠幫到你：
1準(zhǔn)備好加了新鮮培養(yǎng)基的多孔板，并在實(shí)驗(yàn)前于37°C下預(yù)平衡
2使用傳代次數(shù)少并具有推薦融合度或密度（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）的細(xì)胞
3針對(duì)于貼壁細(xì)胞，需限制胰蛋白酶暴露時(shí)間，仔細(xì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分離情況
4根據(jù)優(yōu)化方案進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并使用適量細(xì)胞數(shù)；所用細(xì)胞過(guò)少可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡率增加，所用細(xì)胞過(guò)多可能導(dǎo)致細(xì)胞電轉(zhuǎn)效率降低
5采用高質(zhì)量DNA，使用內(nèi)毒素去除試劑盒進(jìn)行純化；請(qǐng)通過(guò)測(cè)定A260:A280比值檢查各質(zhì)粒制備液的純度
6室溫下以離心速度80-100×g和方案規(guī)定的時(shí)間進(jìn)行離心
7離心后加入Nucleofector™溶液，混勻溶液/細(xì)胞沉淀制備成單細(xì)胞懸液，避免對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行額外操作或用移液器槍頭重復(fù)抽吸
8Nucleofection™核轉(zhuǎn)后，用核轉(zhuǎn)試劑盒內(nèi)配的一次性移液管在電轉(zhuǎn)耗材中的細(xì)胞頂部加入約500μL預(yù)熱培養(yǎng)基
輕輕將一次性移液管吸頭置于電轉(zhuǎn)耗材底部，收集細(xì)胞
將細(xì)胞懸液輕輕接種至制備的多孔板中
請(qǐng)勿重復(fù)吹吸混合細(xì)胞
