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細胞培養(yǎng)在科研和生物制藥中被廣泛應用，支原體污染問題頻繁出現(xiàn)，污染會影響細胞的生長、形態(tài)、生化特點和遺傳特征。因此，為了提高生物制品的有效性和安全性，各國監(jiān)管機構和法規(guī)都建議使用適當?shù)臋z測方法對細胞進行檢測，以確保使用的細胞無支原體污染。

迄今為止，已經有多種支原體檢測方法，包括培養(yǎng)法、指示細胞法、基于核酸擴增（NAT）的方法和基于酶促反應的方法（生化法），每種方法都有各自的特點和應用范圍。培養(yǎng)法作為經典方法，通過有無支原體生長進行判斷，最直接，但是檢測時間是一個最大的挑戰(zhàn)；指示細胞法檢測時間稍微有所縮短，但是靈敏度是一個問題。NAT方法檢測時間短，是直接對支原體的核酸進行擴增，但是覆蓋率和準確度以及對死活支原體的區(qū)分有一定的挑戰(zhàn)；基于酶促反應的生化法檢測的時間最短，對活的支原體進行檢測，靈敏度適中。

生化法是基于支原體的生化活性的檢測方法，相關試劑盒可檢測支原體酶，如乙酸激酶和氨基甲酸酯激酶。這些酶能夠在磷酸乙酰基和磷酸氨基甲酰基底物存在下催化ADP轉化為ATP，進而在熒光素酶作用下使得熒光素底物反應釋放化學發(fā)光信號。靈敏度較高、準確、特異和快速（20mins）是生化法檢測的主要優(yōu)點。推薦用于細胞、培養(yǎng)基、血清等樣品的快速污染檢測和篩查。

生化法檢測原理：

表1常見三種支原體檢測方法的比較

題為“Sensitivityof biochemical test in comparison with other methods for thedetection of mycoplasma contamination in human and animal cell linesstored in the National Cell Bank of Iran"論文采用培養(yǎng)法、生化法（LonzaMycoAlert®試劑盒）和PCR法對細胞庫大量的細胞進行污染檢測，并對這些方法的敏感性、特異性、準確性和便捷性（速度）進行了比較，認為MycoAlert生化法由于其靈敏度、特異性和檢測速度的多方面優(yōu)勢，可被視為傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和DNA染色熒光染料方法的替代方法。這與美國藥典（USP）的描述內容一致，“Avalidated nucleic acid amplification technique(NAT) or an enzymaticactivity based method may be used to detect Mycoplasma"[1]。

該研究中，研究人員隨機選取了40種不同的人和動物細胞系，分別以Vero和NSO細胞系為陽性和陰性對照，使用培養(yǎng)法、生化法和PCR方法進行支原體檢測。結果匯總如下：

表2三種方法檢測結果

檢測結果進行SPSS統(tǒng)計學分析并以培養(yǎng)法為參照，計算陽性和陰性結果的敏感性、特異性、準確性和預測值，統(tǒng)計結果見圖1。

圖1.三種支原體檢測方法在特異性、敏感性和準確性參數(shù)上的統(tǒng)計學比較由此結果可以看出：生化法具有出色的靈敏度、準確度、特異性，而且檢測時間短（＜20mins），可以成為培養(yǎng)法和染色法的較好替代。該方法只能檢測活的支原體，因此可以跟PCR法形成較好的檢測互補。

研究中所使用的生化法試劑盒MycoAlert來自于Lonza,作為業(yè)內生化法支原體檢測試劑盒，其檢測靈敏度為＜50cfu/mL，對A.laidlawii、M.hyorhinis和M.orale的靈敏度為10~20cfu/mL[2]。

圖2.MycoAlert®試劑盒檢測示意圖和靈敏度結果

目前Lonza已經推出了升級版本的支原體試劑盒MycoAlert®Plus，除了可以在Lonza Lucetta™ 2檢測設備之外，由于其更佳的檢測靈敏度，還可以使用各種酶標儀進行高通量支原體檢測[3-8]。

產品特點：

• 簡單快速：20分鐘出結果

• 使用方便：細胞上清與試劑混合，兩次讀值，計算比值即可

• 應用廣泛：可檢測所有常規(guī)的支原體和無膽甾原體的污染，適用于多種樣品類型

• 靈敏度佳：＜50cfu/mL靈敏度，有效避免假陰性結果

• 多種選擇：不同規(guī)格試劑盒可供選擇

• 整體方案：試劑盒中含有實驗所需試劑，可以配套Lonza Lucetta™ 2檢測儀和化學發(fā)光功能酶標儀系統(tǒng)
  

參考文獻：

[1]Chapter <63> Mycoplasma Tests. The United States Pharmacopeia's(USP)

[2]MycoAlert™ mycoplasma detection kit, Mycoplasma detection assay -Instructions for use.©2011Lonza Walkersville, Inc.

[3]MycoAlert Mycoplasma Detection Assays on Molecular Devices MicroplateReaders. Application Note. ©2015 Molecular Devices, LLC

[4]Lonza's MycoAlert assay on a BMG LABTECH plate reader. BMG LABTECHResources|Application notes|AN130

[5]Mycoplasm detection with the MycoAlert™ assay system. ApplicationNote 2007, ©Tecan Trading AG

[6]Biotek: Mycoplasma Detection Using Synergy 2 Multi-Mode MicroplateReader and the Lonza MycoAlert Assay. Application Note. ©2008 BioTekInstruments, Inc.

[7]MycoAlert Mycoplasma Detection Assay (Lonza)on the SpectraMax LMicroplate Luminometer. SpectraMax Application Note #21. ©2010Molecular Devices, Inc.

[8]Detecting Mycoplasma using MycoAlert®on the GloMax®-Multi+ Detection System. Promega