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細(xì)胞培養(yǎng)在科研和生物制藥中被廣泛應(yīng)用，支原體污染問(wèn)題頻繁出現(xiàn)，污染會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)、生化特點(diǎn)和遺傳特征。因此，為了提高生物制品的有效性和安全性，各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)和法規(guī)都建議使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，以確保使用的細(xì)胞無(wú)支原體污染。

迄今為止，已經(jīng)有多種支原體檢測(cè)方法，包括培養(yǎng)法、指示細(xì)胞法、基于核酸擴(kuò)增（NAT）的方法和基于酶促反應(yīng)的方法（生化法），每種方法都有各自的特點(diǎn)和應(yīng)用范圍。培養(yǎng)法作為經(jīng)典方法，通過(guò)有無(wú)支原體生長(zhǎng)進(jìn)行判斷，最直接，但是檢測(cè)時(shí)間是一個(gè)最大的挑戰(zhàn)；指示細(xì)胞法檢測(cè)時(shí)間稍微有所縮短，但是靈敏度是一個(gè)問(wèn)題。NAT方法檢測(cè)時(shí)間短，是直接對(duì)支原體的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，但是覆蓋率和準(zhǔn)確度以及對(duì)死活支原體的區(qū)分有一定的挑戰(zhàn)；基于酶促反應(yīng)的生化法檢測(cè)的時(shí)間最短，對(duì)活的支原體進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度適中。

生化法是基于支原體的生化活性的檢測(cè)方法，相關(guān)試劑盒可檢測(cè)支原體酶，如乙酸激酶和氨基甲酸酯激酶。這些酶能夠在磷酸乙酰基和磷酸氨基甲酰基底物存在下催化ADP轉(zhuǎn)化為ATP，進(jìn)而在熒光素酶作用下使得熒光素底物反應(yīng)釋放化學(xué)發(fā)光信號(hào)。靈敏度較高、準(zhǔn)確、特異和快速（20mins）是生化法檢測(cè)的主要優(yōu)點(diǎn)。推薦用于細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清等樣品的快速污染檢測(cè)和篩查。

生化法檢測(cè)原理：

表1常見(jiàn)三種支原體檢測(cè)方法的比較

題為“Sensitivityof biochemical test in comparison with other methods for thedetection of mycoplasma contamination in human and animal cell linesstored in the National Cell Bank of Iran"論文采用培養(yǎng)法、生化法（LonzaMycoAlert®試劑盒）和PCR法對(duì)細(xì)胞庫(kù)大量的細(xì)胞進(jìn)行污染檢測(cè)，并對(duì)這些方法的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和便捷性（速度）進(jìn)行了比較，認(rèn)為MycoAlert生化法由于其靈敏度、特異性和檢測(cè)速度的多方面優(yōu)勢(shì)，可被視為傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和DNA染色熒光染料方法的替代方法。這與美國(guó)藥典（USP）的描述內(nèi)容一致，“Avalidated nucleic acid amplification technique(NAT) or an enzymaticactivity based method may be used to detect Mycoplasma"[1]。

該研究中，研究人員隨機(jī)選取了40種不同的人和動(dòng)物細(xì)胞系，分別以Vero和NSO細(xì)胞系為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，使用培養(yǎng)法、生化法和PCR方法進(jìn)行支原體檢測(cè)。結(jié)果匯總?cè)缦拢?/p>

表2三種方法檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并以培養(yǎng)法為參照，計(jì)算陽(yáng)性和陰性結(jié)果的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1.三種支原體檢測(cè)方法在特異性、敏感性和準(zhǔn)確性參數(shù)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較由此結(jié)果可以看出：生化法具有出色的靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性，而且檢測(cè)時(shí)間短（＜20mins），可以成為培養(yǎng)法和染色法的較好替代。該方法只能檢測(cè)活的支原體，因此可以跟PCR法形成較好的檢測(cè)互補(bǔ)。

研究中所使用的生化法試劑盒MycoAlert來(lái)自于Lonza,作為業(yè)內(nèi)生化法支原體檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)靈敏度為＜50cfu/mL，對(duì)A.laidlawii、M.hyorhinis和M.orale的靈敏度為10~20cfu/mL[2]。

圖2.MycoAlert®試劑盒檢測(cè)示意圖和靈敏度結(jié)果

目前Lonza已經(jīng)推出了升級(jí)版本的支原體試劑盒MycoAlert®Plus，除了可以在Lonza Lucetta™ 2檢測(cè)設(shè)備之外，由于其更佳的檢測(cè)靈敏度，還可以使用各種酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量支原體檢測(cè)[3-8]。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

• 簡(jiǎn)單快速：20分鐘出結(jié)果

• 使用方便：細(xì)胞上清與試劑混合，兩次讀值，計(jì)算比值即可

• 應(yīng)用廣泛：可檢測(cè)所有常規(guī)的支原體和無(wú)膽甾原體的污染，適用于多種樣品類型

• 靈敏度佳：＜50cfu/mL靈敏度，有效避免假陰性結(jié)果

• 多種選擇：不同規(guī)格試劑盒可供選擇

• 整體方案：試劑盒中含有實(shí)驗(yàn)所需試劑，可以配套Lonza Lucetta™ 2檢測(cè)儀和化學(xué)發(fā)光功能酶標(biāo)儀系統(tǒng)
  

參考文獻(xiàn)：

[1]Chapter <63> Mycoplasma Tests. The United States Pharmacopeia's(USP)

[2]MycoAlert™ mycoplasma detection kit, Mycoplasma detection assay -Instructions for use.©2011Lonza Walkersville, Inc.

[3]MycoAlert Mycoplasma Detection Assays on Molecular Devices MicroplateReaders. Application Note. ©2015 Molecular Devices, LLC

[4]Lonza's MycoAlert assay on a BMG LABTECH plate reader. BMG LABTECHResources|Application notes|AN130

[5]Mycoplasm detection with the MycoAlert™ assay system. ApplicationNote 2007, ©Tecan Trading AG

[6]Biotek: Mycoplasma Detection Using Synergy 2 Multi-Mode MicroplateReader and the Lonza MycoAlert Assay. Application Note. ©2008 BioTekInstruments, Inc.

[7]MycoAlert Mycoplasma Detection Assay (Lonza)on the SpectraMax LMicroplate Luminometer. SpectraMax Application Note #21. ©2010Molecular Devices, Inc.

[8]Detecting Mycoplasma using MycoAlert®on the GloMax®-Multi+ Detection System. Promega