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Revvity小動物活體光學(xué)成像技術(shù)已在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床前醫(yī)學(xué)研究及藥物 研發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在眾多應(yīng)用領(lǐng)域中，神經(jīng)疾病研究是活體光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng) 用熱點(diǎn)之一。在應(yīng)用活體光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)相關(guān)疾病研究中，常用的標(biāo)記方法及應(yīng) 用領(lǐng)域包括：1、利用螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）或熒光蛋白作為報告基因， 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等細(xì)胞，進(jìn)行神經(jīng)腫瘤、神經(jīng)發(fā) 育及細(xì)胞治療的相關(guān)研究；2、利用熒光素酶作為報告基因標(biāo)記神經(jīng)疾病相關(guān)基因構(gòu)建 轉(zhuǎn)基因動物，進(jìn)行神經(jīng)疾病機(jī)理研究；3、利用功能性熒光探針監(jiān)測神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā) 展。下面結(jié)合一些具體實(shí)例進(jìn)行闡述：

一.神經(jīng)腫瘤研究

與其它類型腫瘤研究類似，利用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)可以長期監(jiān)測神經(jīng)腫瘤的 發(fā)生發(fā)展及治療效果。例如，利用熒光素酶基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，通過腫瘤發(fā)光情況的變 化，觀測腫瘤的生長及藥物對于腫瘤的治療效果，如下：

除了利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)腫瘤研究，還可應(yīng)用功能性熒光探針監(jiān)測腫 瘤，例如，通過應(yīng)用熒光染料標(biāo)記的DHE探測神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的活性氧自由基，從而監(jiān) 測腫瘤的發(fā)展情況?；?IVIS 系統(tǒng)的多模式成像功能，可以同時應(yīng)用生物發(fā)光及熒光 成像功能共同監(jiān)測腫瘤，如下：

上圖：左.應(yīng)用熒光成像技術(shù)觀測尾靜脈注射DHE后觀測DHE對腫瘤的靶向；中.應(yīng)用生物發(fā)光成像技術(shù)觀 測經(jīng)熒光素酶基因標(biāo)記的腫瘤；右.熒光與生物發(fā)光成像結(jié)果融合。

二.神經(jīng)退行性疾病的研究

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化，以導(dǎo)致 功能障礙。常見的神經(jīng)退行性疾病包括阿茲海默癥、帕金森氏病、多發(fā)性硬化癥、脊髓 性肌癥等。應(yīng)用小動物活體成像技術(shù)進(jìn)行上述疾病相關(guān)研究的主要方式為：1、通 過構(gòu)建生物發(fā)光標(biāo)記的疾病動物模型，觀測疾病特異性基因的表達(dá)，進(jìn)而反映疾病的發(fā) 生發(fā)展；2、應(yīng)用功能性熒光探針觀測疾病特異性標(biāo)識物，進(jìn)而反映疾病的發(fā)生發(fā)展。 下面以阿茲海默癥的研究為例進(jìn)行闡述：

阿茲海默癥（Alzheimer disease，AD），是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病。AD的病因及 發(fā)病機(jī)制尚未闡明，特征性病理改變?yōu)棣碌矸蹣拥鞍壮练e形成的細(xì)胞外老年斑和tau蛋 白過度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元丟失伴隨膠質(zhì)細(xì)胞增生 等?；谔厥獾牟±硖卣鳎芯空呖梢酝ㄟ^不同思路應(yīng)用活體光學(xué)成像技術(shù)，對阿茲海 默癥進(jìn)行觀測。

如 Wattnoek 等人基于阿茲海默癥的發(fā)生伴隨膠質(zhì)細(xì)胞增生的病理特征推測，伴隨 阿茲海默癥的發(fā)生發(fā)展，膠質(zhì)細(xì)胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表達(dá)量也會增多。利用Western Blot及免疫組化等技術(shù)手段進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)顯示， 隨著β淀粉樣蛋白表達(dá)的增多，GFAP的表達(dá)量也同時增多，兩者在疾病發(fā)展過程中成正相關(guān)，說明GFAP可以作為阿茲海默癥的特征性蛋白而反映阿茲海默癥的發(fā)生發(fā)展。 接著，研究者將Tg(GFAP-luc)生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠與阿茲海默疾病模型小鼠Tg(APP23) 及Tg(CRND8)進(jìn)行雜交，構(gòu)建出Tg(APP23:Gfap-luc) 和 Tg(CRND8:Gfap-luc)雙轉(zhuǎn)基因 生物發(fā)光-阿茲海默疾病模型小鼠，并應(yīng)用IVIS系統(tǒng)在活體水平觀測阿茲海默癥的發(fā)生 發(fā)展。結(jié)果顯示，在兩種雙轉(zhuǎn)基因疾病模型小鼠中，GFAP的表達(dá)量均隨阿茲海默癥病 情的惡化而升高，說明GFAP可以表征阿茲海默癥的發(fā)生發(fā)展；另外，將病情嚴(yán)重的老 年疾病小鼠腦勻漿注射入年輕疾病小鼠腦內(nèi)，會使年輕疾病小鼠中GFAP表達(dá)量的增多 明顯提前，說明老年疾病小鼠腦勻漿物質(zhì)能夠加速年輕疾病小鼠阿茲海默癥的發(fā)生。綜 上所述，通過利用熒光素酶標(biāo)記疾病相關(guān)基因而構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠，并結(jié)合活體光學(xué)成 像技術(shù)，可以在活體水平觀測神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，并開展相關(guān)治療的研究。

上圖：體外分析GFAP的表達(dá)與阿茲海默癥的關(guān)系。A.應(yīng)用Western blot技術(shù)分析GFAP及Aβ在不同年齡 的兩種阿茲海默疾病模型小鼠中的表達(dá)情況；B.定量分析顯示GFAP與Aβ的表達(dá)成正相關(guān)；C.應(yīng)用免疫組 化技術(shù)分析GFAP與Aβ在阿茲海默疾病模型小鼠中的表達(dá)情況。

隨著熒光功能性探針的發(fā)展，研究者除了可以應(yīng)用生物發(fā)光活體成像技術(shù)研究神經(jīng) 退行性疾病，還可應(yīng)用活體熒光成像技術(shù)開展該方面研究。目前科研人員已開發(fā)出一些 有效的熒光功能性探針，它們通過尾靜脈注射后能夠順利通過血腦屏障，并特異性靶向 結(jié)合β淀粉樣蛋白，通過熒光信號監(jiān)測腦中β淀粉樣蛋白的含量，進(jìn)而反映阿茲海默癥 的發(fā)生發(fā)展。Okamura等人報道，他們利用自己研發(fā)的熒光探針THK-265，在活體水平 成功觀測到阿茲海默疾病模型小鼠腦部β淀粉樣蛋白的沉積。如下圖所示，將 THK-265 尾靜脈注射入19 個月及32個月的阿茲海默疾病模型小鼠Tg(APP23)體內(nèi)，利用 IVIS 系統(tǒng)觀測不同時間點(diǎn) THK-265 在腦部的信號，結(jié)果顯示，與未發(fā)生阿茲海默癥的正常 小鼠相比，疾病模型小鼠腦部的熒光信號均較高，表明 THK-265 能夠有效探測疾病模 型小鼠腦部更多的β淀粉樣蛋白沉積；而與19個月的疾病小鼠相比，32個月的疾病小 鼠腦部的熒光信號更高，表明32個月的疾病小鼠患病程度更嚴(yán)重。

Ran 等報道了利用他們自行研發(fā)的基于姜黃素的熒光探針CRANAD-3，進(jìn)行β淀粉 樣蛋白的活體觀測。CRANAD-3探針本身具有熒光性，有趣的是，當(dāng)探針未與Aβ結(jié)合 時，其最大吸收峰為700nm，而一旦與Aβ結(jié)合，其最大吸收峰將會藍(lán)移至640nm。利 用探針的這一特性，研究者不但可以觀測到患有阿茲海默癥的小鼠腦中更多的Aβ沉積， 而且可以利用IVIS系統(tǒng)的光譜分離技術(shù)，區(qū)分與Aβ特異性結(jié)合的探針及未與Aβ結(jié)合 的游離探針，進(jìn)而獲得更準(zhǔn)確的成像及定量分析結(jié)果。

三.神經(jīng)干細(xì)胞研究

與其它類型干細(xì)胞研究類似，應(yīng)用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)，可以在活體水平監(jiān)測 神經(jīng)干細(xì)胞的移植、存活和增殖，以及示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的分布和遷移。由于神經(jīng)疾病 發(fā)生的部位主要集中于顱內(nèi)及脊髓等相對較深的區(qū)域，而生物發(fā)光成像技術(shù)的靈敏 度使得神經(jīng)干細(xì)胞在上述區(qū)域的觀測成為可能。下圖所示為利用生物發(fā)光成像技術(shù)，對 神經(jīng)干細(xì)胞在顱內(nèi)或脊髓移植后的存活及增殖進(jìn)行長期觀測。

干細(xì)胞移植后，活體示蹤干細(xì)胞的分布和遷徙具有重要意義。通過示蹤，不僅可以 直觀地了解其在體內(nèi)的分布，而且可以追蹤到其體內(nèi)的分化轉(zhuǎn)歸及調(diào)控機(jī)制。神經(jīng)干細(xì) 胞增殖及遷移的缺陷是造成帕金森氏病等神經(jīng)退行性疾病的主要原因。神經(jīng)干細(xì)胞起源 于側(cè)腦室外側(cè)壁的室管膜下層區(qū)域（subventricular zone，SVZ）與海馬齒狀回（dentate gyrus，DG），之后通過嘴側(cè)遷移流（rostral migratory stream，RMS）到達(dá)嗅球（olfactory bulb，OB），進(jìn)一步分化為中樞神經(jīng)細(xì)胞并融入現(xiàn)有的神經(jīng)通路。2008年發(fā)表于Stem Cell 上的一篇文獻(xiàn)報道了利用生物發(fā)光成像技術(shù)觀測神經(jīng)干細(xì)胞的上述遷移情況。如下圖所 示：

四.研究神經(jīng)疾病中相關(guān)基因的表達(dá)

對于神經(jīng)疾病中相關(guān)特異性基因的研究，可以揭示神經(jīng)疾病的分子機(jī)理，更好的了 解神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)治療。小動物活體光學(xué)成像技術(shù)已越來越多的應(yīng)用于此類 研究。研究者通過構(gòu)建各種生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因動物，結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，在活體動物 水平觀測神經(jīng)疾病發(fā)展過程中相關(guān)基因的表達(dá)。

Cordeau 等利用Tg(GFAP-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠，監(jiān)測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發(fā)的 腦膜炎中的表達(dá)。研究者用細(xì)菌熒光素酶（bacterial luciferase）基因標(biāo)記肺炎鏈球菌， 以監(jiān)測細(xì)菌在活體動物體內(nèi)的感染情況，同時以螢火蟲熒光素酶基因標(biāo)記的 Tg(GFAP-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，觀測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發(fā)的腦膜炎中 的表達(dá)，以及經(jīng)抗生素治療后細(xì)菌的感染情況和GFAP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著細(xì) 菌感染程度及范圍的升高和擴(kuò)大，GFAP的表達(dá)量也相應(yīng)升高；而經(jīng)抗生素治療后，細(xì) 菌的感染情況明顯被抑制，GFAP的表達(dá)量也隨之降低。對小鼠感染腦部的體外成像結(jié) 果顯示，細(xì)菌對于腦部局部區(qū)域的感染，能引發(fā)整個腦部GFAP的大量表達(dá)。

上圖：應(yīng)用IVIS系統(tǒng)觀測肺炎鏈球菌在Tg(GFAP-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠中的感染情況及GFAP的表達(dá)情況。A. 活體成像結(jié)果，untreated：未經(jīng)抗生素治療，treated：經(jīng)抗生素治療；B.腦部體外成像結(jié)果。

Luo 等利用Tg(GFAP-luc)及Tg(SBE-luc) 轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，觀 測了在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中與 GFAP 表達(dá)相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的聚集及與 TGF-β 信號通路相關(guān)的炎癥的發(fā)生。研究者用髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白（MOG）免疫小 鼠，引發(fā)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，隨后，利用IVIS系統(tǒng)觀測患病Tg(GFAP-luc)及 Tg(SBE-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠中 GFAP 及 TGF-β 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，小鼠免疫后的第 7 天，即可觀測到GFAP 及TGF-β 表達(dá)量顯著升高，說明在腦脊髓炎的發(fā)病初期，即伴 隨有星形膠質(zhì)細(xì)胞的聚集以及炎癥的發(fā)生。值得注意的是，腦脊髓炎的明顯臨床癥狀出 現(xiàn)于免疫后11 天，因此，與觀察臨床癥狀而診斷疾病發(fā)生的方法相比，通過應(yīng)用活體 光學(xué)成像技術(shù)觀測疾病相關(guān)基因的表達(dá)，能夠更早的觀測到疾病的發(fā)生。

Lalancette-Herbert 等利用 Tg(TLR2-luc) 轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，觀 測了小膠質(zhì)細(xì)胞中Toll-like receptor 2 (TLR2)在大腦中動脈閉塞（MCAO）導(dǎo)致的腦缺 血損傷模型中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷會激活小膠質(zhì)細(xì)胞，引起TLR2的長期大量 表達(dá)（可持續(xù)數(shù)月），并且TLR2的表達(dá)不僅存在于腦部發(fā)生缺血損傷的區(qū)域，而且存 在于嗅球中，說明嗅球中的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)性炎癥中起重要調(diào)節(jié)作用。