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Revvity小動物活體光學成像技術已在生命科學基礎研究、臨床前醫學研究及藥物 研發等領域得到廣泛應用。在眾多應用領域中，神經疾病研究是活體光學成像技術的應 用熱點之一。在應用活體光學成像技術進行神經相關疾病研究中，常用的標記方法及應 用領域包括：1、利用螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）或熒光蛋白作為報告基因， 通過轉基因技術體外轉染神經腫瘤細胞、神經干細胞等細胞，進行神經腫瘤、神經發 育及細胞治療的相關研究；2、利用熒光素酶作為報告基因標記神經疾病相關基因構建 轉基因動物，進行神經疾病機理研究；3、利用功能性熒光探針監測神經疾病的發生發 展。下面結合一些具體實例進行闡述：

一.神經腫瘤研究

與其它類型腫瘤研究類似，利用小動物活體光學成像技術可以長期監測神經腫瘤的 發生發展及治療效果。例如，利用熒光素酶基因標記腫瘤細胞，通過腫瘤發光情況的變 化，觀測腫瘤的生長及藥物對于腫瘤的治療效果，如下：

除了利用生物發光成像技術進行神經腫瘤研究，還可應用功能性熒光探針監測腫 瘤，例如，通過應用熒光染料標記的DHE探測神經膠質瘤中的活性氧自由基，從而監 測腫瘤的發展情況。基于 IVIS 系統的多模式成像功能，可以同時應用生物發光及熒光 成像功能共同監測腫瘤，如下：

上圖：左.應用熒光成像技術觀測尾靜脈注射DHE后觀測DHE對腫瘤的靶向；中.應用生物發光成像技術觀 測經熒光素酶基因標記的腫瘤；右.熒光與生物發光成像結果融合。

二.神經退行性疾病的研究

神經退行性疾病是由神經元或其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化，以導致 功能障礙。常見的神經退行性疾病包括阿茲海默癥、帕金森氏病、多發性硬化癥、脊髓 性肌癥等。應用小動物活體成像技術進行上述疾病相關研究的主要方式為：1、通 過構建生物發光標記的疾病動物模型，觀測疾病特異性基因的表達，進而反映疾病的發 生發展；2、應用功能性熒光探針觀測疾病特異性標識物，進而反映疾病的發生發展。 下面以阿茲海默癥的研究為例進行闡述：

阿茲海默癥（Alzheimer disease，AD），是一種中樞神經系統變性病。AD的病因及 發病機制尚未闡明，特征性病理改變為β淀粉樣蛋白沉積形成的細胞外老年斑和tau蛋 白過度磷酸化形成的神經細胞內神經原纖維纏結，以及神經元丟失伴隨膠質細胞增生 等。基于特殊的病理特征，研究者可以通過不同思路應用活體光學成像技術，對阿茲海 默癥進行觀測。

如 Wattnoek 等人基于阿茲海默癥的發生伴隨膠質細胞增生的病理特征推測，伴隨 阿茲海默癥的發生發展，膠質細胞中膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表達量也會增多。利用Western Blot及免疫組化等技術手段進行體外實驗顯示， 隨著β淀粉樣蛋白表達的增多，GFAP的表達量也同時增多，兩者在疾病發展過程中成正相關，說明GFAP可以作為阿茲海默癥的特征性蛋白而反映阿茲海默癥的發生發展。 接著，研究者將Tg(GFAP-luc)生物發光轉基因小鼠與阿茲海默疾病模型小鼠Tg(APP23) 及Tg(CRND8)進行雜交，構建出Tg(APP23:Gfap-luc) 和 Tg(CRND8:Gfap-luc)雙轉基因 生物發光-阿茲海默疾病模型小鼠，并應用IVIS系統在活體水平觀測阿茲海默癥的發生 發展。結果顯示，在兩種雙轉基因疾病模型小鼠中，GFAP的表達量均隨阿茲海默癥病 情的惡化而升高，說明GFAP可以表征阿茲海默癥的發生發展；另外，將病情嚴重的老 年疾病小鼠腦勻漿注射入年輕疾病小鼠腦內，會使年輕疾病小鼠中GFAP表達量的增多 明顯提前，說明老年疾病小鼠腦勻漿物質能夠加速年輕疾病小鼠阿茲海默癥的發生。綜 上所述，通過利用熒光素酶標記疾病相關基因而構建的轉基因小鼠，并結合活體光學成 像技術，可以在活體水平觀測神經退行性疾病的發生發展，并開展相關治療的研究。

上圖：體外分析GFAP的表達與阿茲海默癥的關系。A.應用Western blot技術分析GFAP及Aβ在不同年齡 的兩種阿茲海默疾病模型小鼠中的表達情況；B.定量分析顯示GFAP與Aβ的表達成正相關；C.應用免疫組 化技術分析GFAP與Aβ在阿茲海默疾病模型小鼠中的表達情況。

隨著熒光功能性探針的發展，研究者除了可以應用生物發光活體成像技術研究神經 退行性疾病，還可應用活體熒光成像技術開展該方面研究。目前科研人員已開發出一些 有效的熒光功能性探針，它們通過尾靜脈注射后能夠順利通過血腦屏障，并特異性靶向 結合β淀粉樣蛋白，通過熒光信號監測腦中β淀粉樣蛋白的含量，進而反映阿茲海默癥 的發生發展。Okamura等人報道，他們利用自己研發的熒光探針THK-265，在活體水平 成功觀測到阿茲海默疾病模型小鼠腦部β淀粉樣蛋白的沉積。如下圖所示，將 THK-265 尾靜脈注射入19 個月及32個月的阿茲海默疾病模型小鼠Tg(APP23)體內，利用 IVIS 系統觀測不同時間點 THK-265 在腦部的信號，結果顯示，與未發生阿茲海默癥的正常 小鼠相比，疾病模型小鼠腦部的熒光信號均較高，表明 THK-265 能夠有效探測疾病模 型小鼠腦部更多的β淀粉樣蛋白沉積；而與19個月的疾病小鼠相比，32個月的疾病小 鼠腦部的熒光信號更高，表明32個月的疾病小鼠患病程度更嚴重。

Ran 等報道了利用他們自行研發的基于姜黃素的熒光探針CRANAD-3，進行β淀粉 樣蛋白的活體觀測。CRANAD-3探針本身具有熒光性，有趣的是，當探針未與Aβ結合 時，其最大吸收峰為700nm，而一旦與Aβ結合，其最大吸收峰將會藍移至640nm。利 用探針的這一特性，研究者不但可以觀測到患有阿茲海默癥的小鼠腦中更多的Aβ沉積， 而且可以利用IVIS系統的光譜分離技術，區分與Aβ特異性結合的探針及未與Aβ結合 的游離探針，進而獲得更準確的成像及定量分析結果。

三.神經干細胞研究

與其它類型干細胞研究類似，應用小動物活體光學成像技術，可以在活體水平監測 神經干細胞的移植、存活和增殖，以及示蹤干細胞在體內的分布和遷移。由于神經疾病 發生的部位主要集中于顱內及脊髓等相對較深的區域，而生物發光成像技術的靈敏 度使得神經干細胞在上述區域的觀測成為可能。下圖所示為利用生物發光成像技術，對 神經干細胞在顱內或脊髓移植后的存活及增殖進行長期觀測。

干細胞移植后，活體示蹤干細胞的分布和遷徙具有重要意義。通過示蹤，不僅可以 直觀地了解其在體內的分布，而且可以追蹤到其體內的分化轉歸及調控機制。神經干細 胞增殖及遷移的缺陷是造成帕金森氏病等神經退行性疾病的主要原因。神經干細胞起源 于側腦室外側壁的室管膜下層區域（subventricular zone，SVZ）與海馬齒狀回（dentate gyrus，DG），之后通過嘴側遷移流（rostral migratory stream，RMS）到達嗅球（olfactory bulb，OB），進一步分化為中樞神經細胞并融入現有的神經通路。2008年發表于Stem Cell 上的一篇文獻報道了利用生物發光成像技術觀測神經干細胞的上述遷移情況。如下圖所 示：

四.研究神經疾病中相關基因的表達

對于神經疾病中相關特異性基因的研究，可以揭示神經疾病的分子機理，更好的了 解神經疾病的發生發展及相關治療。小動物活體光學成像技術已越來越多的應用于此類 研究。研究者通過構建各種生物發光轉基因動物，結合活體光學成像技術，在活體動物 水平觀測神經疾病發展過程中相關基因的表達。

Cordeau 等利用Tg(GFAP-luc)轉基因小鼠，監測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發的 腦膜炎中的表達。研究者用細菌熒光素酶（bacterial luciferase）基因標記肺炎鏈球菌， 以監測細菌在活體動物體內的感染情況，同時以螢火蟲熒光素酶基因標記的 Tg(GFAP-luc)轉基因小鼠為實驗動物，觀測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發的腦膜炎中 的表達，以及經抗生素治療后細菌的感染情況和GFAP的表達情況。結果顯示，隨著細 菌感染程度及范圍的升高和擴大，GFAP的表達量也相應升高；而經抗生素治療后，細 菌的感染情況明顯被抑制，GFAP的表達量也隨之降低。對小鼠感染腦部的體外成像結 果顯示，細菌對于腦部局部區域的感染，能引發整個腦部GFAP的大量表達。

上圖：應用IVIS系統觀測肺炎鏈球菌在Tg(GFAP-luc)轉基因小鼠中的感染情況及GFAP的表達情況。A. 活體成像結果，untreated：未經抗生素治療，treated：經抗生素治療；B.腦部體外成像結果。

Luo 等利用Tg(GFAP-luc)及Tg(SBE-luc) 轉基因小鼠，結合活體光學成像技術，觀 測了在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中與 GFAP 表達相關的星形膠質細胞的聚集及與 TGF-β 信號通路相關的炎癥的發生。研究者用髓磷脂少突細胞糖蛋白（MOG）免疫小 鼠，引發實驗性自身免疫性腦脊髓炎，隨后，利用IVIS系統觀測患病Tg(GFAP-luc)及 Tg(SBE-luc)轉基因小鼠中 GFAP 及 TGF-β 的表達情況。結果顯示，小鼠免疫后的第 7 天，即可觀測到GFAP 及TGF-β 表達量顯著升高，說明在腦脊髓炎的發病初期，即伴 隨有星形膠質細胞的聚集以及炎癥的發生。值得注意的是，腦脊髓炎的明顯臨床癥狀出 現于免疫后11 天，因此，與觀察臨床癥狀而診斷疾病發生的方法相比，通過應用活體 光學成像技術觀測疾病相關基因的表達，能夠更早的觀測到疾病的發生。

Lalancette-Herbert 等利用 Tg(TLR2-luc) 轉基因小鼠，結合活體光學成像技術，觀 測了小膠質細胞中Toll-like receptor 2 (TLR2)在大腦中動脈閉塞（MCAO）導致的腦缺 血損傷模型中的表達情況，發現腦缺血損傷會激活小膠質細胞，引起TLR2的長期大量 表達（可持續數月），并且TLR2的表達不僅存在于腦部發生缺血損傷的區域，而且存 在于嗅球中，說明嗅球中的小膠質細胞在神經性炎癥中起重要調節作用。