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Revvity小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)已在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床前醫(yī)學(xué)研究及藥物 研發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在眾多應(yīng)用領(lǐng)域中，免疫研究是活體光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用熱 點(diǎn)之一。在應(yīng)用活體光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行免疫學(xué)研究中，常用的標(biāo)記方法及應(yīng)用領(lǐng)域包括 ：1、利用功能性探針監(jiān)測(cè)免疫疾病的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)治療；2、利用熒光素酶基因或熒 光染料標(biāo)記免疫細(xì)胞，監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用；3、利用熒光素酶作為報(bào)告基因 標(biāo)記疾病相關(guān)基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，進(jìn)行免疫疾病機(jī)理研究。下面結(jié)合一些具體實(shí)例進(jìn) 行闡述：

一.監(jiān)測(cè)免疫疾病的發(fā)生發(fā)展及治療效果

伴隨免疫疾病研究的深入，目前已開(kāi)發(fā)出一系列針對(duì)免疫疾病監(jiān)測(cè)的功能性探針， 這些探針的設(shè)計(jì)大多是基于在免疫疾病中表達(dá)的特征性分子或酶，通過(guò)對(duì)特征性分子或 酶的監(jiān)測(cè)而反映疾病的發(fā)生發(fā)展。利用這些探針并結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，研究者可以 方便快捷地在活體動(dòng)物水平監(jiān)測(cè)免疫疾病的發(fā)生發(fā)展及治療效果。

如在各種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展中，通常會(huì)伴隨大量活性氧自由基（ROS）及氧化脅 迫的產(chǎn)生。研究者根據(jù)上述特征，設(shè)計(jì)出能夠特異性探測(cè) ROS 或氧化脅迫相關(guān)酶的功 能性探針用于炎性疾病的檢測(cè)。Lee等應(yīng)用其自行研發(fā)的表面結(jié)合透明質(zhì)酸的金納米顆 粒（HA-AuNPs）成功檢測(cè)了小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。該納米顆粒表面結(jié)合了熒光染料標(biāo)記 的透明質(zhì)酸，當(dāng)未被激活時(shí)，由于熒光染料及納米顆粒本身的相互作用而處于熒光湮滅 狀態(tài)，而表面結(jié)合的透明質(zhì)酸一旦被 ROS 或透明質(zhì)酸酶剪切，便會(huì)被外界光源激發(fā)而 發(fā)光。應(yīng)用該探針并結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，便可在活體動(dòng)物水平靈敏監(jiān)測(cè)到炎性疾病 的發(fā)生。

Revvity依靠強(qiáng)大的生物學(xué)研發(fā)團(tuán)隊(duì)，成功開(kāi)發(fā)出多種應(yīng)用于炎性疾病監(jiān)測(cè)的功能 性探針，如用于探測(cè)炎性細(xì)胞中髓過(guò)氧化物酶（MPO）的化學(xué)發(fā)光 （Chemiluminescent）探針“XenoLight® RediJect™ Inflammation Probe"、用于探測(cè)環(huán) 氧酶2（COX-2）的近紅外熒光探針“XenoLight®RediJect™COX-2 Probe"、用于探測(cè) 炎性細(xì)胞中組織蛋白酶（Cathepsin）的近紅外探針“ProSense 680/750"、用于探測(cè)炎性 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase）的近紅外探針“MMPSense 680/750"、 用于探測(cè)嗜中性粒細(xì)胞胰肽酶（Neutrophil Elastase）的近紅外探針“Neutrophil Elastase 680 FAST"。這些探針已被廣泛應(yīng)用于各種炎性疾病的研究中。

二.監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答

免疫應(yīng)答是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過(guò)程。這個(gè) 過(guò)程是免疫系統(tǒng)各部分生理功能的綜合體現(xiàn)，包括了抗原遞呈、淋巴細(xì)胞活化、免疫分 子形成及免疫效應(yīng)發(fā)生等一系列的生理反應(yīng)。通過(guò)有效的免疫應(yīng)答，機(jī)體得以維護(hù)內(nèi)環(huán) 境的穩(wěn)定。免疫細(xì)胞在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，了解免疫細(xì)胞的作用機(jī)理是 免疫學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)?；铙w光學(xué)成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞的相關(guān)研究，通過(guò)該 技術(shù)可以在活體動(dòng)物水平監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞在相關(guān)疾病中的遷移、分布及功能。目前用于標(biāo) 記免疫細(xì)胞的主要方法包括：1、通過(guò)帶有熒光素酶基因或熒光蛋白基因的病毒載體穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染人源或鼠源免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞具有發(fā)光性質(zhì)；2、直接從轉(zhuǎn)基因發(fā)光小鼠中 提取免疫細(xì)胞，所獲得的免疫細(xì)胞即有發(fā)光性質(zhì)；3、通過(guò)特定的熒光染料直接標(biāo)記免 疫細(xì)胞使其具有發(fā)光性質(zhì)。研究者可根據(jù)具體研究，選擇合適的標(biāo)記方法對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn) 行標(biāo)記。

利用帶有熒光素酶基因的病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞的好處在于：1、生物發(fā)光靈 敏度高，可以滿足少量被標(biāo)記免疫細(xì)胞的活體觀測(cè)；2、由于是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，因此發(fā)光特 性可以傳代，不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞的分裂或分化而改變，可以進(jìn)行數(shù)周或更長(zhǎng)時(shí)間的觀測(cè)。

如Rabinovich 等人利用增強(qiáng)型螢火蟲(chóng)熒光素酶基因（effluc）標(biāo)記T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其 發(fā)光強(qiáng)度比傳統(tǒng)螢火蟲(chóng)熒光素酶（ffluc）高出至少100倍，將標(biāo)記的T細(xì)胞皮下移植后， 利用IVIS系統(tǒng)能夠非常靈敏的觀測(cè)到3個(gè)細(xì)胞發(fā)出的光信號(hào)。

Santos 等利用橈足類動(dòng)物膜結(jié)合型熒光素酶基因（ext GLuc）標(biāo)記T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其 發(fā)光強(qiáng)度較螢火蟲(chóng)熒光素酶（ffluc）及海腎熒光素酶（Rluc）均有大幅提升。另外，研 究者將ext GLuc標(biāo)記的T細(xì)胞尾靜脈注射入攜帶淋巴瘤A20（OVA）的SCID小鼠體 內(nèi)，應(yīng)用IVIS系統(tǒng)對(duì)T細(xì)胞在體內(nèi)的分布進(jìn)行長(zhǎng)期觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞能夠有效靶向腫 瘤，并對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。

通過(guò)上述帶有熒光素酶基因的病毒載體在體外轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞，需要一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 及操作成熟度，并且與腫瘤細(xì)胞相比，免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低，沒(méi)有成熟的實(shí)驗(yàn)操作 經(jīng)驗(yàn)較難獲取熒光素酶高表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。而通過(guò)從組成型（ubiquitous）表達(dá)或特異 性（inducible）表達(dá)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)光小鼠中提取免疫細(xì)胞的方法相對(duì)方便， 無(wú)需自行進(jìn)行標(biāo)記，用提取的具有發(fā)光性質(zhì)的免疫細(xì)胞即可開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。目前市場(chǎng)上已有 多種商業(yè)化的發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠供研究者選擇購(gòu)買(mǎi)，如用組成型表達(dá)啟動(dòng)子控制熒光素酶 基因表達(dá)而構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠Tg(β-actin-luc)和Tg(CMV-luc)，其全身均有熒光素酶的表 達(dá)，因此從脾、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓等提取的免疫細(xì)胞即具備發(fā)光性質(zhì)。

Cheeran 等利用從轉(zhuǎn)基因小鼠Tg(β-actin-luc)中提取的脾細(xì)胞及淋巴結(jié)細(xì)胞，研究了 免疫細(xì)胞對(duì)病毒感染的響應(yīng)。研究者將提取的發(fā)光脾細(xì)胞及淋巴結(jié)細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注入 腦室內(nèi)感染巨細(xì)胞病毒的小鼠，利用 IVIS 系統(tǒng)觀測(cè)了上述免疫細(xì)胞在活體動(dòng)物體內(nèi)對(duì) 感染病灶點(diǎn)的浸潤(rùn)。結(jié)果顯示，在未經(jīng)病毒感染的正常小鼠體內(nèi)，移植的淋巴細(xì)胞主要 聚集于脾內(nèi)（如下圖-1dpi所示），而當(dāng)小鼠腦部感染病毒后，這些淋巴細(xì)胞會(huì)遷移至感 染區(qū)域而發(fā)揮免疫作用。

Chewning 等構(gòu)建了利用T細(xì)胞特異性表達(dá)的人CD2基因啟動(dòng)子控制熒光素酶基因 表達(dá)的表達(dá)載體，并應(yīng)用該載體構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因小鼠，從該轉(zhuǎn)基因小鼠中提取的發(fā)光細(xì)胞 即為T(mén)細(xì)胞。研究者將提取的發(fā)光T細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入由OVA誘導(dǎo)而引發(fā)炎癥的小鼠 體內(nèi)，應(yīng)用IVIS系統(tǒng)觀測(cè)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

除了上述兩種通過(guò)熒光素酶基因?qū)γ庖呒?xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的方法之外，通過(guò)膜嵌合型熒 光染料標(biāo)記免疫細(xì)胞的方法則更為簡(jiǎn)便，研究者只需依據(jù)染料標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)流程，即可自 行完成對(duì)免疫細(xì)胞的標(biāo)記。目前市場(chǎng)上主要的膜嵌合型熒光染料包括 DiD、DiL、DiR 等，它們均是通過(guò)自身親脂性的長(zhǎng)碳鏈插入目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中而進(jìn)行標(biāo)記。使用此種 方式進(jìn)行標(biāo)記的好處在于操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但由于是膜嵌合性標(biāo)記，因此被標(biāo)記細(xì)胞的發(fā) 光性質(zhì)不會(huì)傳代，只能用于觀測(cè)免疫細(xì)胞在體內(nèi)的短時(shí)間動(dòng)態(tài)變化。

之前的研究顯示，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展通常伴隨有腫瘤周邊的炎癥發(fā)生，而炎性細(xì)胞 在腫瘤周邊炎癥區(qū)域的聚集是炎癥發(fā)生的必要條件。Sista 等利用DiD染料體外標(biāo)記了 單核細(xì)胞，并利用 IVIS 系統(tǒng)觀測(cè)了尾靜脈注射的單核細(xì)胞對(duì)原發(fā)性乳腺癌的靶向聚集 情況。

三.免疫疾病機(jī)理研究

對(duì)于炎性相關(guān)基因的研究，可以揭示免疫疾病的分子機(jī)理，更好的了解免疫疾病的 發(fā)生發(fā)展及相關(guān)治療。小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)已越來(lái)越多的應(yīng)用于此類研究。研究者 通過(guò)構(gòu)建各種生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，在活體動(dòng)物水平觀測(cè)免疫 疾病發(fā)展過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)。目前市場(chǎng)上已有不少成熟的可用于炎癥研究的生物發(fā) 光轉(zhuǎn)基因小鼠，這些小鼠的構(gòu)建通常是用炎性相關(guān)基因的啟動(dòng)子特異性控制熒光素酶基 因的表達(dá)，從而通過(guò)發(fā)光情況反映炎癥的發(fā)生及治療效果。下圖列舉了幾種可應(yīng)用于相 關(guān)免疫疾病研究的生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究者可以從美國(guó)Taconic公司購(gòu)買(mǎi)。

NFκB 是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子 都受NF-κB 的調(diào)控，因此，對(duì)于 NFκB 信號(hào)通路的研究是炎癥疾病研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 Paur 等利用Tg(NFκB-RE-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠，觀測(cè)了咖啡對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥的抑制作用。 結(jié)果顯示，咖啡能夠抑制NFκB的表達(dá)，并激活機(jī)體的抗氧化防御，而且隨著咖啡烘焙 程度的提高，這種抑制效應(yīng)越明顯。因此，利用Tg(NFκB-RE-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠可以觀測(cè) 炎癥的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)藥物的治療效果。

一氧化氮（NO）是細(xì)胞內(nèi)的一種具有生物活性的重要調(diào)節(jié)分子，它既是是組織損 傷的誘發(fā)因子和各種病變的增強(qiáng)因子，也是免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)性分子。在炎性條件下，體 內(nèi)NO主要由炎性細(xì)胞中的誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶（iNOS）產(chǎn)生，在敗血癥、關(guān)節(jié)炎、 心血管疾病等多種炎性疾病中起調(diào)節(jié)作用。LPS及多種細(xì)胞因子如干擾素IFN-γ等可激 活iNOS的表達(dá)。下圖所示為應(yīng)用Tg(iNos-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠觀測(cè)不同抗炎藥物對(duì)iNOS表 達(dá)的抑制效應(yīng)。研究者利用LPS誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，對(duì)iNOS特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠施 加不同抗炎藥物，應(yīng)用IVIS系統(tǒng)觀測(cè)了不同抗炎藥物對(duì)iNOS表達(dá)的抑制效果。

Cordeau 等利用Tg(GFAP-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠，監(jiān)測(cè)GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發(fā)的 腦膜炎中的表達(dá)。研究者用細(xì)菌熒光素酶（bacterial luciferase）基因標(biāo)記肺炎鏈球菌， 以監(jiān)測(cè)細(xì)菌在活體動(dòng)物體內(nèi)的感染情況，同時(shí)以螢火蟲(chóng)熒光素酶基因標(biāo)記的 Tg(GFAP-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀測(cè)GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發(fā)的腦膜炎中 的表達(dá)，以及經(jīng)抗生素治療后細(xì)菌的感染情況和GFAP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著細(xì)菌感染程度及范圍的升高和擴(kuò)大，GFAP的表達(dá)量也相應(yīng)升高；而經(jīng)抗生素治療后，細(xì) 菌的感染情況明顯被抑制，GFAP的表達(dá)量也隨之降低。對(duì)小鼠感染腦部的體外成像結(jié) 果顯示，細(xì)菌對(duì)于腦部局部區(qū)域的感染，能引發(fā)整個(gè)腦部GFAP的大量表達(dá)。

Luo 等利用Tg(GFAP-luc)及Tg(SBE-luc) 轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，觀 測(cè)了在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中與 GFAP 表達(dá)相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的聚集及與 TGF-β 信號(hào)通路相關(guān)的炎癥的發(fā)生。研究者用髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白（MOG）免疫小 鼠，引發(fā)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，隨后，利用IVIS系統(tǒng)觀測(cè)患病Tg(GFAP-luc)及 Tg(SBE-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠中 GFAP 及 TGF-β 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，小鼠免疫后的第 7 天，即可觀測(cè)到GFAP 及TGF-β 表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明在腦脊髓炎的發(fā)病初期，即伴 隨有星形膠質(zhì)細(xì)胞的聚集以及炎癥的發(fā)生。值得注意的是，腦脊髓炎的明顯臨床癥狀出 現(xiàn)于免疫后11 天，因此，與觀察臨床癥狀而診斷疾病發(fā)生的方法相比，通過(guò)應(yīng)用活體 光學(xué)成像技術(shù)觀測(cè)疾病相關(guān)基因的表達(dá)，能夠更早的觀測(cè)到疾病的發(fā)生。