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Revvity小動物活體光學成像技術已在生命科學基礎研究、臨床前醫學研究及藥物 研發等領域得到廣泛應用。在眾多應用領域中，免疫研究是活體光學成像技術的應用熱 點之一。在應用活體光學成像技術進行免疫學研究中，常用的標記方法及應用領域包括 ：1、利用功能性探針監測免疫疾病的發生發展及相關治療；2、利用熒光素酶基因或熒 光染料標記免疫細胞，監測免疫細胞的免疫應答作用；3、利用熒光素酶作為報告基因 標記疾病相關基因構建轉基因動物，進行免疫疾病機理研究。下面結合一些具體實例進 行闡述：

一.監測免疫疾病的發生發展及治療效果

伴隨免疫疾病研究的深入，目前已開發出一系列針對免疫疾病監測的功能性探針， 這些探針的設計大多是基于在免疫疾病中表達的特征性分子或酶，通過對特征性分子或 酶的監測而反映疾病的發生發展。利用這些探針并結合活體光學成像技術，研究者可以 方便快捷地在活體動物水平監測免疫疾病的發生發展及治療效果。

如在各種炎性疾病的發生發展中，通常會伴隨大量活性氧自由基（ROS）及氧化脅 迫的產生。研究者根據上述特征，設計出能夠特異性探測 ROS 或氧化脅迫相關酶的功 能性探針用于炎性疾病的檢測。Lee等應用其自行研發的表面結合透明質酸的金納米顆 粒（HA-AuNPs）成功檢測了小鼠關節炎的發生。該納米顆粒表面結合了熒光染料標記 的透明質酸，當未被激活時，由于熒光染料及納米顆粒本身的相互作用而處于熒光湮滅 狀態，而表面結合的透明質酸一旦被 ROS 或透明質酸酶剪切，便會被外界光源激發而 發光。應用該探針并結合活體光學成像技術，便可在活體動物水平靈敏監測到炎性疾病 的發生。

Revvity依靠強大的生物學研發團隊，成功開發出多種應用于炎性疾病監測的功能 性探針，如用于探測炎性細胞中髓過氧化物酶（MPO）的化學發光 （Chemiluminescent）探針“XenoLight® RediJect™ Inflammation Probe"、用于探測環 氧酶2（COX-2）的近紅外熒光探針“XenoLight®RediJect™COX-2 Probe"、用于探測 炎性細胞中組織蛋白酶（Cathepsin）的近紅外探針“ProSense 680/750"、用于探測炎性 細胞中基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase）的近紅外探針“MMPSense 680/750"、 用于探測嗜中性粒細胞胰肽酶（Neutrophil Elastase）的近紅外探針“Neutrophil Elastase 680 FAST"。這些探針已被廣泛應用于各種炎性疾病的研究中。

二.監測免疫細胞的免疫應答

免疫應答是機體免疫系統對抗原刺激所產生的以排除抗原為目的的生理過程。這個 過程是免疫系統各部分生理功能的綜合體現，包括了抗原遞呈、淋巴細胞活化、免疫分 子形成及免疫效應發生等一系列的生理反應。通過有效的免疫應答，機體得以維護內環 境的穩定。免疫細胞在機體的免疫應答中發揮著重要作用，了解免疫細胞的作用機理是 免疫學研究的重要環節。活體光學成像技術已廣泛應用于免疫細胞的相關研究，通過該 技術可以在活體動物水平監測免疫細胞在相關疾病中的遷移、分布及功能。目前用于標 記免疫細胞的主要方法包括：1、通過帶有熒光素酶基因或熒光蛋白基因的病毒載體穩 定轉染人源或鼠源免疫細胞，使免疫細胞具有發光性質；2、直接從轉基因發光小鼠中 提取免疫細胞，所獲得的免疫細胞即有發光性質；3、通過特定的熒光染料直接標記免 疫細胞使其具有發光性質。研究者可根據具體研究，選擇合適的標記方法對免疫細胞進 行標記。

利用帶有熒光素酶基因的病毒載體穩定轉染免疫細胞的好處在于：1、生物發光靈 敏度高，可以滿足少量被標記免疫細胞的活體觀測；2、由于是穩定轉染，因此發光特 性可以傳代，不會因為細胞的分裂或分化而改變，可以進行數周或更長時間的觀測。

如Rabinovich 等人利用增強型螢火蟲熒光素酶基因（effluc）標記T細胞，發現其 發光強度比傳統螢火蟲熒光素酶（ffluc）高出至少100倍，將標記的T細胞皮下移植后， 利用IVIS系統能夠非常靈敏的觀測到3個細胞發出的光信號。

Santos 等利用橈足類動物膜結合型熒光素酶基因（ext GLuc）標記T細胞，發現其 發光強度較螢火蟲熒光素酶（ffluc）及海腎熒光素酶（Rluc）均有大幅提升。另外，研 究者將ext GLuc標記的T細胞尾靜脈注射入攜帶淋巴瘤A20（OVA）的SCID小鼠體 內，應用IVIS系統對T細胞在體內的分布進行長期觀測，發現T細胞能夠有效靶向腫 瘤，并對腫瘤細胞具有殺傷作用。

通過上述帶有熒光素酶基因的病毒載體在體外轉染免疫細胞，需要一定的實驗基礎 及操作成熟度，并且與腫瘤細胞相比，免疫細胞的轉染效率較低，沒有成熟的實驗操作 經驗較難獲取熒光素酶高表達的轉染細胞株。而通過從組成型（ubiquitous）表達或特異 性（inducible）表達熒光素酶基因的轉基因發光小鼠中提取免疫細胞的方法相對方便， 無需自行進行標記，用提取的具有發光性質的免疫細胞即可開展實驗。目前市場上已有 多種商業化的發光轉基因小鼠供研究者選擇購買，如用組成型表達啟動子控制熒光素酶 基因表達而構建的轉基因小鼠Tg(β-actin-luc)和Tg(CMV-luc)，其全身均有熒光素酶的表 達，因此從脾、淋巴結、胸腺、骨髓等提取的免疫細胞即具備發光性質。

Cheeran 等利用從轉基因小鼠Tg(β-actin-luc)中提取的脾細胞及淋巴結細胞，研究了 免疫細胞對病毒感染的響應。研究者將提取的發光脾細胞及淋巴結細胞通過尾靜脈注入 腦室內感染巨細胞病毒的小鼠，利用 IVIS 系統觀測了上述免疫細胞在活體動物體內對 感染病灶點的浸潤。結果顯示，在未經病毒感染的正常小鼠體內，移植的淋巴細胞主要 聚集于脾內（如下圖-1dpi所示），而當小鼠腦部感染病毒后，這些淋巴細胞會遷移至感 染區域而發揮免疫作用。

Chewning 等構建了利用T細胞特異性表達的人CD2基因啟動子控制熒光素酶基因 表達的表達載體，并應用該載體構建出轉基因小鼠，從該轉基因小鼠中提取的發光細胞 即為T細胞。研究者將提取的發光T細胞經尾靜脈注入由OVA誘導而引發炎癥的小鼠 體內，應用IVIS系統觀測T細胞的免疫應答。

除了上述兩種通過熒光素酶基因對免疫細胞進行標記的方法之外，通過膜嵌合型熒 光染料標記免疫細胞的方法則更為簡便，研究者只需依據染料標記的實驗流程，即可自 行完成對免疫細胞的標記。目前市場上主要的膜嵌合型熒光染料包括 DiD、DiL、DiR 等，它們均是通過自身親脂性的長碳鏈插入目標細胞的細胞膜中而進行標記。使用此種 方式進行標記的好處在于操作相對簡單，但由于是膜嵌合性標記，因此被標記細胞的發 光性質不會傳代，只能用于觀測免疫細胞在體內的短時間動態變化。

之前的研究顯示，乳腺癌的發生發展通常伴隨有腫瘤周邊的炎癥發生，而炎性細胞 在腫瘤周邊炎癥區域的聚集是炎癥發生的必要條件。Sista 等利用DiD染料體外標記了 單核細胞，并利用 IVIS 系統觀測了尾靜脈注射的單核細胞對原發性乳腺癌的靶向聚集 情況。

三.免疫疾病機理研究

對于炎性相關基因的研究，可以揭示免疫疾病的分子機理，更好的了解免疫疾病的 發生發展及相關治療。小動物活體光學成像技術已越來越多的應用于此類研究。研究者 通過構建各種生物發光轉基因動物，結合活體光學成像技術，在活體動物水平觀測免疫 疾病發展過程中相關基因的表達。目前市場上已有不少成熟的可用于炎癥研究的生物發 光轉基因小鼠，這些小鼠的構建通常是用炎性相關基因的啟動子特異性控制熒光素酶基 因的表達，從而通過發光情況反映炎癥的發生及治療效果。下圖列舉了幾種可應用于相 關免疫疾病研究的生物發光轉基因小鼠模型，研究者可以從美國Taconic公司購買。

NFκB 是一類重要的轉錄因子，參與免疫反應的早期和炎癥反應各階段的許多分子 都受NF-κB 的調控，因此，對于 NFκB 信號通路的研究是炎癥疾病研究的一個熱點。 Paur 等利用Tg(NFκB-RE-luc)轉基因小鼠，觀測了咖啡對LPS誘導的炎癥的抑制作用。 結果顯示，咖啡能夠抑制NFκB的表達，并激活機體的抗氧化防御，而且隨著咖啡烘焙 程度的提高，這種抑制效應越明顯。因此，利用Tg(NFκB-RE-luc)轉基因小鼠可以觀測 炎癥的發生發展及相關藥物的治療效果。

一氧化氮（NO）是細胞內的一種具有生物活性的重要調節分子，它既是是組織損 傷的誘發因子和各種病變的增強因子，也是免疫應答的調節性分子。在炎性條件下，體 內NO主要由炎性細胞中的誘導性一氧化氮合成酶（iNOS）產生，在敗血癥、關節炎、 心血管疾病等多種炎性疾病中起調節作用。LPS及多種細胞因子如干擾素IFN-γ等可激 活iNOS的表達。下圖所示為應用Tg(iNos-luc)轉基因小鼠觀測不同抗炎藥物對iNOS表 達的抑制效應。研究者利用LPS誘導炎癥的發生，對iNOS特異性表達的轉基因小鼠施 加不同抗炎藥物，應用IVIS系統觀測了不同抗炎藥物對iNOS表達的抑制效果。

Cordeau 等利用Tg(GFAP-luc)轉基因小鼠，監測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發的 腦膜炎中的表達。研究者用細菌熒光素酶（bacterial luciferase）基因標記肺炎鏈球菌， 以監測細菌在活體動物體內的感染情況，同時以螢火蟲熒光素酶基因標記的 Tg(GFAP-luc)轉基因小鼠為實驗動物，觀測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發的腦膜炎中 的表達，以及經抗生素治療后細菌的感染情況和GFAP的表達情況。結果顯示，隨著細菌感染程度及范圍的升高和擴大，GFAP的表達量也相應升高；而經抗生素治療后，細 菌的感染情況明顯被抑制，GFAP的表達量也隨之降低。對小鼠感染腦部的體外成像結 果顯示，細菌對于腦部局部區域的感染，能引發整個腦部GFAP的大量表達。

Luo 等利用Tg(GFAP-luc)及Tg(SBE-luc) 轉基因小鼠，結合活體光學成像技術，觀 測了在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中與 GFAP 表達相關的星形膠質細胞的聚集及與 TGF-β 信號通路相關的炎癥的發生。研究者用髓磷脂少突細胞糖蛋白（MOG）免疫小 鼠，引發實驗性自身免疫性腦脊髓炎，隨后，利用IVIS系統觀測患病Tg(GFAP-luc)及 Tg(SBE-luc)轉基因小鼠中 GFAP 及 TGF-β 的表達情況。結果顯示，小鼠免疫后的第 7 天，即可觀測到GFAP 及TGF-β 表達量顯著升高，說明在腦脊髓炎的發病初期，即伴 隨有星形膠質細胞的聚集以及炎癥的發生。值得注意的是，腦脊髓炎的明顯臨床癥狀出 現于免疫后11 天，因此，與觀察臨床癥狀而診斷疾病發生的方法相比，通過應用活體 光學成像技術觀測疾病相關基因的表達，能夠更早的觀測到疾病的發生。