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今年2月16日，Iovance Biotherapeutics公司宣布FDA加速批準其腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）療法AMTAGVI（lifileucel）上市，用于治療先前經過PD-1抗體治療的不可切除或轉移性黑色素瘤成年患者。據悉，lifileucel是款獲批上市的TIL細胞療法，標志著細胞療法在腫瘤治療領域的又一重要里程碑。
開發有效的TIL療法需要對TIL細胞本身的功能特性的深入理解，更取決于如何開發能夠快速擴增且保持TIL細胞功能的生產工藝。在TIL回輸到患者體內，治療作用的持久性如何保持，也需要對T細胞的動力學有更深入的了解。IsoSpark/IsoLight單細胞功能蛋白質組學表征平臺自上市以來，在細胞治療領域被應用于不同的研發階段。在TIL療法領域，關于TIL的功能研究、生產工藝評估和回輸后的免疫監控上都已經有應用案例。其中近期備受關注的Iovance在其生產工藝的優化中也使用到IsoCode單細胞適應性免疫芯片，用于評估TIL細胞的多功能性。我們今天再重溫一下幾個經典案例。
案例1：TIL生產工藝開發過程中T細胞功能評估
研究目的
Iovance開發第二代生產工藝（Generation-2）擴增的TIL，是否讓TIL細胞群體重新激活，相對于內源性TIL（D0），經過22天的培養擴增后得到的細胞產品功能評估。
實驗設計
從消化的腫瘤活檢中分離的內源性CD3+ TIL（D0）進行分選，并與使用 Iovance的Gen 2工藝擴增22天后（D22）的TIL進行比較（圖1）。來自黑色素瘤、宮頸癌和頭頸部鱗狀細胞癌的7對D0和D22 TIL的T細胞亞群，利用TCR復合物激活后上樣到IsoCode單細胞適應性免疫芯片上，評估比較D0和D22兩個時間點CD4+和CD8+ T細胞的多功能性。
圖1. 實驗流程圖和IsoCode單細胞分泌蛋白組芯片靶標
實驗結果
當TIL細胞剛剛從腫瘤組織中分離出來時，幾乎沒有多功能細胞。經過Iovance第二代TIL擴增培養22天后，TIL中CD8+和CD4+的多功能性細胞比例和PSI（細胞多功能強度指數）顯著升高，共計八種細胞因子被檢測到。說明Iovance的第二代（Gen2）TIL擴增方案從多功能細胞角度能夠讓T細胞有效激活。
結論
IsoCode單細胞分泌蛋白組芯片提供對于TIL細胞治療產品工藝變更后對工藝進行評估。
圖2. IsoCode單細胞分泌蛋白組芯片分析腫瘤中分離出的TIL（D0）和擴增后TIL（D22）功能。
案例2: 多組學表征腫瘤中CD8+T細胞
研究目的
對多個患者隊列和六大類腫瘤類型的CD8+ T細胞特征進行多組學分析。通過生成的scRNA-seq 和 scTCR-seq 數據以及使用薈萃數據集進行概念驗證分析。這些概念在功能上用原始患者樣本進行了功能等多方面的驗證。這使研究者能夠精確地定義富集CD8 + TEX的人類腫瘤與其他類型的功能低下CD8 + T細胞的不同特征。
實驗設計
單細胞功能蛋白組學平臺用于評估膠質母細胞瘤（GBM）腫瘤組織內CD8+ T細胞的功能。從GBM切除的腫瘤樣本中新鮮分離出患者來源的CD8+ T細胞與健康人PBMC來源CD8+T細胞比較，評估其在anti-CD3/CD28刺激下或無刺激下的功能變化（圖3A）。
圖3. 功能性單細胞分泌組分析揭示GBM來源的CD8+ T細胞的耐受樣表型。
實驗結果
聚類結果顯示，盡管刺激條件相同，PBMC和GBM來源的腫瘤CD8+T細胞顯示出不同聚類（圖3B）。與PBMC相比，激活后的GBM CD8+T細胞的多功能性非常低，變化幅度也明顯更低（圖3C, D）。GBM來源T細胞的PSI不是由效應細胞因子 (IFN-γ) 或炎癥細胞因子 (TNF) 的分泌驅動，而是由促骨髓趨化因子如IL-8、CCL3和CCL4（它們在傷口愈合過程中具有冗余功能）驅動（圖3E）。這些數據表明大多數GBM-CD8+ T細胞功能低下的表型可能會增強促骨髓細胞的功能。
結論
單細胞分泌蛋白組能夠幫助研究者探索不同腫瘤內T細胞的功能狀態，從而更好地理解腫瘤免疫功能，并為后續的免疫治療方式提供深入見解。
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案例 3: TIL治療PD-1耐藥轉移性肺癌患者一期臨床研究
研究目的
此研究位針對PD-1后期耐藥患者加入TIL聯合療法治療的Phase I臨床試驗。所有患者均接受至少四個周期的 PD-1免疫檢測點治療，對PD-1產生耐藥并發生腫瘤進展的患者實施TIL治療。主要終點是安全性，次要終點包括客觀緩解率、緩解持續時間和T細胞持久性，并進行探索性地T細胞分析。
實驗設計
在針對T細胞的持久性和表型的研究中，研究者采集12位患者TIL輸注前、輸注當天和輸注后第4周和第12周PBMC，分選出CD4+和CD8+ T細胞，利用anti-CD3/CD28抗體刺激后進行單細胞功能性評估。
實驗結果
如圖4數據比較顯示了12名患者輸注TIL前后，CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的PSI (Polyfunctional Strength Index，多功能強度指數)，反映了細胞同時表達多種細胞因子及其表達量，再綜合分析因子數及表達量來評估細胞的多功能活性。可以明顯看到CD4+ T細胞和CD8+ T的多功能細胞數量和PSI細胞多功能指數在TIL輸注后顯著增加，進一步證實TIL療法提高T細胞的功能性，對轉移性NSCLC的有效性。
圖4. TIL回輸前后外周T細胞功能變化
"We assessed the polyfunctional strength index (PSI), which is an indicator of the number of cells capable of secreting multiple types of cytokines. Since PSI reflects the ability of a T cell to carry out multiple functions, it is recognized as a metric for the potency of cell therapy, and for the efficacy of vaccines. "
綜上，IsoSpark單細胞功能蛋白質組學平臺能夠幫助研發者：
?深入理解不同腫瘤TIL的功能特征
?評估TIL生產工藝對TIL細胞功能的影響，以促進更好的工藝的開發
?回輸后的免疫細胞功能監測，深入理解TIL的作用動力學和人外周T細胞功能動態變化
參考文獻：
1.Michelle R. Simpson-Abelson,et al. ESMO VIRTUAL CONGRESS 2020,1053P.
2.Naulaerts, Stefan, et al. Science Translational Medicine 15.691 (2023): eadd1016.
3.Creelan, Benjamin C., et al. Nature medicine 27.8 (2021): 1410-1418.
