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熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)讓腫瘤研究事半功倍!

2024-1-9  閱讀(140)

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盡管有些腫瘤或疾病確實(shí)是由于基因組本身遺傳信息改變所致,但是表觀調(diào)控有時(shí)能更好地闡述腫瘤或疾病發(fā)生的機(jī)制。在課題進(jìn)展中,尤其是在確定表型之后,我們往往從表觀調(diào)控,或轉(zhuǎn)錄調(diào)控,或蛋白修飾的方向去研究表型發(fā)生的機(jī)制。差異基因與表型間的關(guān)系往往是比較容易確定的,機(jī)制的挖掘則相對(duì)復(fù)雜!熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Luciferase reporter)是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。作為機(jī)制研究利器,如果我們想要研究某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否能與某一靶啟動(dòng)子片段有作用。首先將靶基因啟動(dòng)子或其他待研究基因調(diào)控元件插入到熒光素酶報(bào)告基因前方,構(gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒。然后,將可以表達(dá)待檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞;如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子,則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá),熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比;再加入特定熒光素酶底物,熒光素酶與底物反應(yīng),產(chǎn)生熒光。通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性,從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。下面小編就給大家介紹一篇熒光素酶在腫瘤機(jī)制研究中的應(yīng)用案例實(shí)驗(yàn)步驟。

第一步:穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶(Luc)基因的腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建。

這篇文章采用的是慢病毒遞送的方式,也是目前構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的主流方法。用含有Luciferase基因的慢病毒質(zhì)粒+MD2G+psPAX2,三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48-72小時(shí)收細(xì)胞上清,然后用去除細(xì)胞碎片的慢病毒感染腫瘤細(xì)胞。感染48-72小時(shí)后,用WB或流式或熒光顯微鏡驗(yàn)證轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。這里同時(shí)插入了Luc和EGFP,中間用IRES隔開(kāi),Luc和GFP獨(dú)立表達(dá),非常巧妙,當(dāng)然也是常用的實(shí)驗(yàn)手段。



第二步:穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的驗(yàn)證。

作者同時(shí)插入了Luc和GFP,因此下面同時(shí)用了流式檢測(cè)GFP陽(yáng)性率和用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了Luc的表達(dá)水平。因?yàn)橛袝r(shí)候慢病毒整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)不一樣,會(huì)破壞宿主基因的表達(dá),可能出現(xiàn)一些好的克隆和差的克隆。作者挑取了3個(gè)克隆,從流式和Luc檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,#12克隆最好。

在此,建議大家在做穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的時(shí)候,至少要挑選和嘗試3個(gè)以上的克隆~



流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)



熒光素酶表達(dá)驗(yàn)證

第三步:體內(nèi)腫瘤模型的建立。

此外,作者還進(jìn)行了皮下接種(subcutaneous,s.c.)和靜脈注射(intravenous,i.v.)穩(wěn)轉(zhuǎn)的腫瘤細(xì)胞系,并分別在接種后第7天和第10天進(jìn)行體內(nèi)成像。與體外結(jié)果一致,#12克隆誘導(dǎo)腫瘤的效果好。到這里已經(jīng)成功建立了小鼠腫瘤模型,后面就可以用作腫瘤治療或敲除的模型了。



監(jiān)測(cè)小鼠白血病模型中的腫瘤負(fù)荷

熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)并不是一個(gè)新技術(shù),也不是多么高大上,但是絕對(duì)是機(jī)制研究的利器。

逐典螢光素酶報(bào)告基因



針對(duì)報(bào)告基因檢測(cè)不同的側(cè)重需求,逐典推出了3種檢測(cè)系統(tǒng)。



逐典螢光素酶報(bào)告基因特點(diǎn):

1. 檢測(cè)靈敏度高,信號(hào)穩(wěn)定性好

HEK293-NFK B-LUC細(xì)胞加入梯度稀釋的TNF 在37C、5%CO條件下刺激6小時(shí)后,分別用增強(qiáng)型、超敏型、穩(wěn)定型檢測(cè)試劑進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。



2. 操作方便

僅需將底物和螢光素酶檢測(cè)緩沖液混合后直接加入到細(xì)胞即可。



3. 穩(wěn)定性好

同時(shí)在10次反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)中,逐典全系列報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒顯示出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。





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