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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔三叉元采用消化法結合元專用培養基培養、化學試劑抑制法篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔三叉元經β-Tubulin-Ⅲ免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

兔三叉元細胞分離自三叉組織；三叉為粗大的混合性腦，含一般軀體感覺和特殊內臟運動兩種纖維。其特殊內臟運動纖維起于腦橋中段的三叉運動核，纖維組成三叉運動根，由腦橋基底部與腦橋臂交界處出腦，位于感覺根下內側，后進入三叉第3支下頜中，經卵圓孔出顱，隨下頜分支分布于咀嚼肌等。運動根內還含有三叉中腦核有關的纖維，主要傳導咀嚼肌的本體感覺。三叉內以軀體感覺纖維為主，這些纖維的細胞體位于三叉節（半月節）內，該節位于顱中窩顴骨巖部的前面三叉壓跡處，為硬腦膜形成的美克爾腔包裹。三叉節由假單極元組成，其中樞突集中構成了粗大的三叉感覺根，由腦橋基底部與腦橋臂交界處入腦，止于三叉諸感覺核，其中傳導痛溫覺的纖維主要終止于三叉脊束核；傳導觸覺的纖維主要終止于三叉腦橋核。三叉節細胞的周圍突組成三叉三大分支，即第1支眼、第2支上頜、第3支為下頜。從3大分支不斷分支分布于面部皮膚、眼及眶內、口腔、鼻腔、鼻旁竇的粘膜、牙、腦膜等，傳導痛、溫、觸等多種感覺。

培養信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml）

培養基：含B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：元細胞樣

傳代特性：屬于終末分化細胞；屬于不增殖細胞群

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔三叉元細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

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