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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | 50130ES72 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 生物產業,制藥/生物制藥 |
產品介紹
NAD/NADH檢測試劑盒|NAD/NADH Assay Kit
產品描述
煙|酰|胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶Ⅰ）是細胞中常見的重要輔因子，通過電子交換參與各種代謝反應。NADH（還原性輔酶I）是NAD的還原態。在氧化還原反應中，NADH作為氫和電子的供體，NAD作為氫和電子的受體，參與多種生理過程。NAD/NADH比率可以反應細胞中氧化還原狀態。
NAD/NADH檢測試劑盒|NAD/NADH Assay Kit試劑盒適用于測定NAD和NADH，背景低，靈敏度高。NADH可以將探針還原為高熒光產物，其信號可以通過熒光酶標儀在Ex/Em = 540/590 nm或在比色測定(OD =576 nm)中定量。
產品組分
組分編號 | 組分名稱 | 組分規格 | 儲存條件 |
50130-A | NAD/NADH Recycling Enzyme Mix | 2 vials | -20℃ |
50130-B | NADH Sensor Buffer | 20 mL×1 | -20℃ |
50130-C | NADH Standard | 1 vial (142 µg) | -20℃ |
50130-D | NADH Extraction Solution | 10 mL×1 | -20℃ |
50130-E | NAD Extraction Solution | 10 mL×1 | -20℃ |
50130-F | NAD/NADH Control Solution | 10 mL×1 | -20℃ |
50130-G | NAD/NADH Lysis Buffer | 10 mL×1 | -20℃ |
運輸和保存方法
冰袋運輸。避光保存于-20℃，有效期1年。
注意事項
1 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
2 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3 粉末溶解前請先短暫離心，以保證產品全在管底。
4 請勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。
5 本產品僅用于科研用途。
實驗過程
1 試劑準備
① NADH標準品母液(1 mM)：將200 μL PBS (pH 7.4)加入NADH Standard（C組分）中制備1 mM NADH標準品母液，用時置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復凍融。
② NADH梯度標準液(0-10 μM)：將970 μL PBS (pH 7.4)加入到30 μL NADH標準母液(1 mM)中制備30 μM NADH標準液，然后取200 μL的30 μM NADH標準液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀釋成NADH梯度標準液(10 μM, 3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.0411 μM)。
【注】：稀釋后的NADH標準液不穩定，應該配置后4 h內使用。
③ NAD/NADH反應液：向每瓶NAD/NADH Recycling Enzyme Mix（組分A）中加入10 mL NADH Sensor Buffer（B組分），混勻。
【注】：相當于96孔板的125次測試的檢測用量。NAD/NADH反應液不穩定，注意避光并盡快使用，未用完的分裝-20°C保存。
④ NAD/NADH Lysis Buffer（組分G）：用前恢復至室溫。
2 樣本制備
2.1 細胞樣本：收集0.5-1×107個細胞，預冷PBS潤洗后，加入100 μL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室溫離心5 min，取上清檢測。
2.2 組織樣本：取20 mg組織樣本，預冷PBS潤洗后，加入400 μL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。
2.3 細菌樣本：4°C 10,000 g離心15 min收集細菌，每107個細菌加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫孵育15 min，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。
2.4 植物樣本：取200 mg葉片，加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。
【注】：建議使用新鮮樣本，如果無法及時進行檢測，樣本建議存于-80 °C，檢測時冰上解凍，但是檢測的熒光值可能會降低。不要使用RIPA裂解液，因為RIPA裂解液會干擾檢測。如果樣本中NADH含量高，注意稀釋樣本。
3 檢測過程
3.1 如下圖，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADH標準液、待測樣本或空白對照(PBS)。
Table 1. Layout of NADH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.
BL | BL | TS (Total) | TS (Total) | TS (NADH) | TS (NADH) | TS (NAD) | TS (NAD) |
NS1 | NS1 | … | … | … | … | ||
NS2 | NS2 | … | … | … | … | ||
NS3 | NS3 | ||||||
NS4 | NS4 | ||||||
NS5 | NS5 | ||||||
NS6 | NS6 | ||||||
NS7 | NS7 |
NS= NADH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated with NAD/NADH Control Solution , TS (NADH) = test sample treated with NADH Extraction Solution, then neutralized by NAD Extraction, TS (NAD) = test sample treated with NAD Extraction Solution, then neutralized by NADH Extraction Solution
3.2 對于NADH的提取TS (NADH)：向待測樣本中加入25 μL NADH Extraction Solution（組分D），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NAD Extraction Solution（組分E）中和。
3.3 對于NAD的提取TS (NAD)：向待測樣本中加入25 μL NAD Extraction Solution（組分E），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADH Extraction Solution（組分D）中和。
3.4 對于總NAD和NADH檢測TS (Total)：向待測樣本中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F）。
3.5 對于NADH標準液NS1-7：向NADH標準液中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，
再加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F）。
Table 2 Reagent composition for each well
Well | Reagent | Treatment | Incubate at RT 10-15 min | Treatment | Total Volume |
NS1-7 | 25 μL NADH Standard (0-10 μM NADH) | 25 μL F | 25 μL F | 75 μL | |
BL | 25 μL PBS (pH 7.4) | 25 μL F | 25 μL F | 75 μL | |
TS (Total) | 25 μL Test sanmple | 25 μL F | 25 μL F | 75 μL | |
TS (NADH) | 25 μL Test sanmple | 25 μL D | 25 μL E | 75 μL | |
TS (NAD) | 25 μL Test sanmple | 25 μL E | 25 μL D | 75 μL |
3.6 每孔中加入75 μL NAD/NADH反應液（測試總體積150 μL），混勻后，室溫避光孵育15 min-2 h。
3.7 熒光酶標儀下測量熒光讀值(Ex/Em=540/590 nm)；也可以使用白色透明96孔板，使用酶標儀在OD=576±5nm的波長下讀數，但靈敏度低于熒光檢測。
【注】：高濃度的NADH（終濃度>300 μM）會導致熒光讀值下降，因為NADH sensor被過度氧化，生成非熒光產物。
數據分析
1 從空白標準孔獲得的讀數用作陰性對照。從其他標準的讀數中減去該值，以獲得基線校正值，熒光背景會隨時間而增加，因此標準品和測試樣本的熒光讀值計算前需減去空白孔的熒光強度值。然后，通過繪制標準讀數以獲得標準曲線和方程。
圖1 NADH標準曲線
加入75 μL NAD/NADH反應液后室溫避光孵育30 min后，熒光酶標儀下測量熒光讀值。
2 樣本中NAD含量計算公式：NAD concentration = (B/V)×D。B代表根據標曲計算出的測試樣本中NAD的含量(μM)，V代表測試樣本體積(μL)，D代表測試樣本稀釋倍數。
3 樣本中總NAD和NADH含量計算公式：Total concentration = (B/V)×D。B代表根據標曲計算出的測試樣本中總的NAD和NADH的含量(μM)，V代表測試樣本體積(μL)，D代表測試樣本稀釋倍數。
4 在健康的哺乳動物細胞中，NAD比NADH多，因此我們建議使用總NAD和NADH含量減去NAD來計算NADH的量。
HB221230
