欧美日韩成人在线,337P粉嫩日本亚洲大胆艺术,色综合久久久无码中文字幕波多,麻豆人妻少妇精品无码专区

翌圣生物科技(上海)股份有限公司

初級會員·13年

聯(lián)系電話

400-6111-883

您現(xiàn)在的位置: 首頁> 技術(shù)文章 > 精品推薦 | 合成生物學(xué)新秀:末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)
初級會員·13年
聯(lián)人:
曹女士
話:
400-6111-883
機(jī):
后:
4006-111-883
真:
86-21-34615995
址:
上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
網(wǎng)址:
www.yeasen.com

掃一掃訪問手機(jī)商鋪

精品推薦 | 合成生物學(xué)新秀:末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)

2025-5-27  閱讀(140)

分享:

前 言

 

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中,DNA聚合酶是構(gòu)建遺傳物質(zhì)的“建筑師",但大多數(shù)聚合酶依賴模板鏈進(jìn)行精準(zhǔn)復(fù)制。而Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)卻打破了這一規(guī)則。作為DNA聚合酶第十家族(Pol X)的成員,TdT具有不依賴模板的DNA合成能力,這一特性使得它在許多領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力,例如作為分子生物學(xué)工具用于基因突變和載體構(gòu)建、開發(fā)基于TdT的生物傳感器用于疾病和金屬含量檢測、在DNA微陣列領(lǐng)域進(jìn)行基因表達(dá)分析和microRNA檢測、基于DNA的新一代信息存儲技術(shù)、酶法從頭合成DNA技術(shù)等。


本文將從TdT的生化特性、核心應(yīng)用場景展開論述,探討末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)在分子生物學(xué)中的價值。


 

01

 

 

TdT的生化特性

無模板合成的“分子魔術(shù)師"

//

 

結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與催化機(jī)制

 

TdT的催化核心由四個結(jié)構(gòu)域組成,整體呈“右手"狀構(gòu)象,與DNA聚合酶β(Pol β)的同源結(jié)構(gòu)域高度相似。其活性中心包含兩個關(guān)鍵基序:ALLGW(T/S)GSR和TGGFRRG。前者通過“打開-關(guān)閉"構(gòu)象轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)底物結(jié)合,后者則依賴精氨酸殘基穩(wěn)定催化反應(yīng)。雙金屬催化機(jī)制(通常為Mn2?或Co2?)是TdT的核心特征:金屬A(如Co2?)在底物結(jié)合階段暫時參與,金屬B(如Mg2?)則持續(xù)穩(wěn)定催化中心。這種機(jī)制使TdT能高效識別含至少3個堿基的引物鏈,甚至對六乙二醇修飾的短鏈也具有活性。

 

圖1.TdT催化的反應(yīng)

 

//

 

底物兼容性與反應(yīng)條件

 

TdT的底物譜廣泛,涵蓋單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)及部分RNA分子。實(shí)驗(yàn)顯示,其對平末端DNA的催化效率顯著高于模板依賴型聚合酶,且對修飾核苷酸(如ddNTP、DIG-dUTP)具有高度兼容性。典型反應(yīng)條件為37℃、60分鐘,1個活性單位定義為在上述條件下催化1 nmol dNTP摻入DNA的酶量。值得注意的是,高濃度銨根離子、氯離子及EDTA會抑制其活性,而Co2?的添加可提升對平末端的催化效率達(dá)3倍以上。

//

 

生理功能與免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)

 

TdT作為誘變因子參與免疫球蛋白和T細(xì)胞受體蛋白基因多樣性形成,該過程發(fā)生在表達(dá)TdT的前淋巴細(xì)胞,在這些細(xì)胞里TdT隨機(jī)添加大約1-10個核苷酸到基因編碼區(qū)末端,從而增加了免疫組庫的多樣性(圖2)。值得注意的是,TdT在V(D)J重組中發(fā)揮作用需要DNA修復(fù)途徑的其他酶(如KU80和XRCC4)協(xié)助,然后被招募到V(D)J重組復(fù)合體。研究表明,敲除TdT基因的小鼠體內(nèi)TCR庫多樣性降低70%,驗(yàn)證了其在免疫應(yīng)答中的核心作用。

 

圖2  .TdT的生物學(xué)功能

 

02

 

 

TdT的核心應(yīng)用場景

從基礎(chǔ)研究到工業(yè)應(yīng)用

//

 

基因工程與載體構(gòu)建

 

TdT在基因工程中的經(jīng)典應(yīng)用是“同聚物加尾法"。通過在載體DNA的3'末端添加dATP或dTTP尾鏈,與互補(bǔ)的外源DNA片段退火連接,可高效構(gòu)建重組質(zhì)粒。例如,在cDNA文庫構(gòu)建中,TdT介導(dǎo)的加尾反應(yīng)使mRNA的3'末端獲得poly(A)尾鏈,從而與含poly(T)的載體特異性結(jié)合,提升克隆效率。此外,在RACE(快速擴(kuò)增cDNA末端)技術(shù)中,TdT通過添加隨機(jī)核苷酸尾鏈,為后續(xù)PCR提供引物結(jié)合位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)全長cDNA的捕獲。

 

圖3 .使用TdT合成DNA

 

//

 

TUNEL技術(shù)

 

細(xì)胞凋亡發(fā)生時,相關(guān)DNA內(nèi)切酶會被激活,從而切斷核小體間的DNA。在細(xì)胞凋亡晚期,DNA會被降解為180-200 bp的片段。 TdT介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)是在TdT的催化下將熒光素標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP)與斷裂DNA暴露的3'-OH聚合,延伸后的DNA可通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。臨床研究顯示,TUNEL在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)診斷中具有特異性。ALL患者骨髓樣本的TdT陽性率達(dá)95%,而成熟淋巴細(xì)胞呈陰性,為疾病分型和預(yù)后評估提供關(guān)鍵依據(jù)。

 

圖4 .TdT標(biāo)記細(xì)胞凋亡

 

//

 

DNA甲基化測序的“接頭工程師"

 

在全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)中,TdT通過添加同聚物尾鏈實(shí)現(xiàn)ssDNA與接頭的連接。具體流程為:

  • 重亞硫酸鹽(Bisulfite)處理DNA,使未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U,變性為ssDNA。 

  • 3′接頭連接,TdT末端轉(zhuǎn)移酶參與目的DNA 3′端添加接頭的過程,催化ssDNA的3′羥基端加上同聚物尾巴(示意圖中橙色曲線部分),從而在連接酶的作用下與接頭進(jìn)行連接。

  • DNA二鏈合成,5′接頭連接。

  • PCR擴(kuò)增獲取含有完整接頭序列的上機(jī)文庫。

圖5. DNA甲基化建庫流程

 

//

 

酶促法DNA合成的“基石"

 

TdT在DNA從頭合成技術(shù)中占據(jù)核心地位。基于其非模板依賴特性,研究者開發(fā)出兩種策略

  • Type I策略:將dNTP的堿基部分通過連接物(linker)與TdT共價連接,形成TdT-dNTP耦合物。耦合物催化引物DNA延伸一個堿基后,產(chǎn)物DNA仍與TdT共價結(jié)合,阻礙后續(xù)添加。通過物理、化學(xué)或生物方法切斷連接物,釋放產(chǎn)物DNA,進(jìn)入下一循環(huán)。

  • Type II策略:使用3'-OH端帶有可逆保護(hù)基團(tuán)的dNTP(如RTdNTPs)。TdT催化RTdNTP添加至引物DNA后,產(chǎn)物DNA因3'-端被保護(hù)而無法繼續(xù)延伸。通過脫保護(hù)步驟去除保護(hù)基團(tuán),恢復(fù)3'-OH,進(jìn)入下一循環(huán)。

 

//

 

DNA微陣列技術(shù)

 

TdT酶(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)在DNA微陣列技術(shù)中主要應(yīng)用于單鏈DNA文庫構(gòu)建及探針標(biāo)記優(yōu)化,通過其非模板依賴的末端延伸特性提升雜交效率與信號強(qiáng)度,同時助力DNA序列的定向修飾,為微陣列檢測的靈敏度和特異性提供關(guān)鍵支持。

 

 

TdT作為分子生物學(xué)工具中的“非模板革命者",其應(yīng)用已從基因工程基礎(chǔ)技術(shù)延伸至臨床診斷和合成生物學(xué)前沿。隨著酶工程改造技術(shù)的進(jìn)步,TdT的穩(wěn)定性、底物兼容性和催化效率將持續(xù)優(yōu)化,為DNA測序、疾病標(biāo)志物開發(fā)及DNA存儲技術(shù)提供更強(qiáng)動力。未來,TdT有望成為連接基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵橋梁,推動生命科學(xué)進(jìn)入精準(zhǔn)調(diào)控的新紀(jì)元。

 

現(xiàn)在翌圣重磅推出具有低殘留、高純度的特點(diǎn)的TdT末端轉(zhuǎn)移酶,高效進(jìn)行DNA末端的同聚物加尾。適用于各種應(yīng)用場景。

 

04

 

 

性能展示

//

 

無切口酶殘留

 

 

切口酶殘留結(jié)果:跑膠結(jié)果顯示兩批次TdT末端轉(zhuǎn)移酶與陰性對照(C)一致,顯示無切口酶殘留。

 

//

 

無核酸外切酶殘留

 

 

核酸外切酶殘留結(jié)果:跑膠結(jié)果顯示兩批次TdT末端轉(zhuǎn)移酶與陰性對照(C)一致,顯示無核酸外切酶酶殘留。

 

05

 

 

產(chǎn)品推薦

產(chǎn)品定位

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號

高效率TdT末端轉(zhuǎn)移酶(帶buffer)

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TdT末端轉(zhuǎn)移酶

10302ES

低濃度高效率TdT末端轉(zhuǎn)移酶(不含buffer)

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (20U/μL, without buffer) TdT 末端轉(zhuǎn)移酶

14456ES

高濃度高效率TdT末端轉(zhuǎn)移酶(不含buffer)

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (100 U/µL) TdT末端轉(zhuǎn)移酶

14453ES

高效率連接酶

E. coliDNA ligase (60 U/μL)

14955ES

DNA純化/分選磁珠

Hieff NGS®DNA Selection Beads

12601ES

文庫定量試劑盒

ssDNA HS Assay Kit

12645ES

甲基化建庫試劑盒

Hieff NGS® Methyl-seq DNA library Prep kit for Illumina V2 甲基化DNA建庫試劑盒V2

12221ES

細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

TUNEL Apoptosis Detection Kit(FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(FITC)

40306ES

 

參考文獻(xiàn):

Chengjie Zhang, et,al.Terminal deoxynucleotidyl transferase: Properties and applications,Engineering Microbiology , Volume 5, Issue 1 , 2025,100179, ISSN 2667-3703.

 

#Terminal Deoxynucleotidyl Transferase  #TdT #末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶



會員登錄

×

請輸入賬號

請輸入密碼

=

請輸驗(yàn)證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏!
標(biāo)簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時間回復(fù)您~
產(chǎn)品對比 二維碼

掃一掃訪問手機(jī)商鋪

對比框

在線留言