欧美日韩成人在线,337P粉嫩日本亚洲大胆艺术,色综合久久久无码中文字幕波多,麻豆人妻少妇精品无码专区

細胞和基因療法（Cell and Gene Therapy, CGT）是通過改變細胞原有基因的表達以達到治療疾病的方法，也即通過對人體細胞和基因進行修復、替換和改造，直接從患者的疾病根源進行治療，臨床應用潛力巨大，有望成為未來新藥發展的主流方向之一。目前CGT治療領域以腫瘤和罕見病為主，逐漸向其他疾病領域拓展。根據Frost &Sullivan測算，全球CGT療法的市場規模有望在2025年達到305.4億美元，對應2020-2025年CAGR高達71.2%。

CGT療法包括以免疫細胞治療、干細胞治療和其它體細胞治療為主的細胞療法，還包括以病毒為載體的基因替代和非病毒載體的基因編輯治療為主的基因療法。細胞與基因治療技術工藝路線主要包含三個方面：質粒、病毒載體和細胞工廠，提升這三個方面的工藝開發技術、大規模生產能力，從而能夠更好地進行質量控制和成本控制。然而在CGT藥物從早期研發、到成功上市需要經歷多個階段，每個階段都存在極其復雜的不確定性，需要對其中多個關鍵點進行嚴格的質量控制，從而確保最終產品的安全性和有效性。

圖1.CGT藥物研發及生產流程中翌圣質控產品推薦

去除宿主細胞雜質是細胞基因治療藥物在內的生物制藥產品生產中的關鍵步驟，其中宿主細胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關鍵質控指標。在此情況下，建立合適的檢測方法監測生產工藝，控制宿主細胞殘留核酸限度，以確保產品的安全性和質量已經成為監管機構和行業內關注的重點。

• 《中國藥典》2020年版三部規定，以細胞基質生產的生物制劑外源宿主細胞DNA殘留量不能超過100pg/劑，以細菌或真菌基質（酵母、大腸桿菌等）表達的生物制品中DNA殘留量不超過10ng/劑；

• 《歐洲藥典》（EP10.0）通則規定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過10ng/劑；

• 美國食品藥品監督管理局（FDA）發布的指導原則中指出生物制品宿主細胞DNA殘留限度不得超過100pg/劑，對于大劑量的生物制品（如單克隆抗體），根據其殘留DNA來源及給藥途徑，DNA殘留量可放寬至10ng/劑。

此外，《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。目前市場上對宿主細胞殘留DNA檢測，主要采用熒光探針qPCR方法，qPCR法具有高的靈敏度、序列特異性和準確性，可為生物制藥工業在工藝研究和成品質量控制方面提供可靠的檢測手段，現也已成為各生物制品廠家檢測方法。

翌圣生物自主研發的E.coli宿主細胞殘留DNA的qPCR法檢測試劑盒，可快速高效檢測生物藥中宿主DNA殘留量。還研發了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。

圖2. E.coli DNA (2G)標曲范圍30fg/μL~300pg/μL，R2=1，擴增效率為101.74%，各濃度檢測值CV<15%

除需對DNA的殘留量進行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關風險因素的重要指標。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp可能會有一定的致病性，且殘留DNA片段越大，生物制品的風險等級越高。

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行業指南中建議將非致瘤性連續細胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

2022年5月，國家藥品監督管理局藥品評審中心（CDE）發布的體內基因治療產品要學研究與評價技術指導原則（試行）中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

目前，行業內對于殘留宿主細胞DNA片段分析，主要是利用毛細管電泳的方法。研究者們開發了一種基于毛細管凝膠電泳與敏感激光誘導熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數宿主細胞殘留DNA片段大小為50～2 000bp。除了毛細管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進行生物制品中生產用細胞相關的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。

針對上述情況，翌圣生物自主研發了E.coli&HEK293殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設計了四種不同的擴增片段（幾十bp、100多bp、200多bp、500多bp），用于定量檢測樣本中宿主細胞殘留DNA片段的大小分布情況。

圖3. 宿主細胞中殘留DNA片段分析檢測流程圖

據了解，各監管機構在判定DNA產品純度時，均會將宿主細胞殘留RNA（HCR）含量作為其中一項關鍵檢測指標。

2022年5月，國家藥品監督管理局藥品評審中心（CDE）發布的體內基因治療產品要學研究與評價技術指導原則（試行）中也明確指出需對生產工藝引入的工藝相關雜質，如宿主細胞RNA等納入產品質量標準進行控制。

美國FDA中明確規定了質粒材料的質量標準：超螺旋DNA＞85%，宿主細胞蛋白＜1%，殘留細菌DNA＜1%（聚合酶鏈式反應測定），殘留細菌RNA＜1%（高效液相色譜法或凝膠法檢測不到）。

歐洲藥品管理局（EMA）在《基因治療藥物產品的質量、非臨床和臨床方面的指導原則》中，提出應考慮宿主細胞殘留RNA，以確定質粒純度。

已知，對于生物制品的起始原材料質粒DNA中的宿主菌RNA殘留檢測，通常采用20年版中國藥典0541通則瓊脂糖凝膠電泳法。此外，USP發布的《mRNA疫苗質量分析方法-指南草案》(第二版)，對于質粒DNA質量屬性的測試中提到了：宿主細胞RNA檢測可采用高效液相色譜或瓊脂糖凝膠電泳法。

除了瓊脂糖凝膠電泳和高效液相色譜法外，行業內還會采用定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）和RNA熒光定量方法檢測生物制品中的宿主細胞殘留RNA。RT-qPCR法由于可實現對待測樣本中的殘留RNA專一性擴增和精確定量，而被廣泛應用。

翌圣生物自主研發的E.coli殘留RNA檢測試劑盒可專一快速檢測樣本中E.coli殘留RNA。

生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產品的關鍵質量屬性(CQA)，是工藝穩健性監測的重要評價指標，也是產品的重要質控指標。各國法規都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

《中國藥典》三部（2020版）規定：針對CHO細胞，HCP殘留需要<0.05%（相當于小于500ppm）；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。

美國藥典USP<1132>章節規定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP，其含量應該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應小于100ng，也即<0.01%）。

酶聯免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發了包括CHO宿主細胞在內的多款HCP蛋白殘留量檢測試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優化、中間工藝過程的雜質控制以及終產品的放行檢測。

圖4. 翌圣HCP ELISA試劑盒產品特點

在治療性藥物（如抗體、病毒載體藥物等）的生產及工藝流程中，核酸雜質的去除至關重要。UltraNuclease全能核酸酶，又稱為廣譜核酸酶、非限制性核酸內切酶，其能夠在多種實驗條件下切割和降解各種形式的DNA和RNA，廣泛用于去除生物制品中的核酸。

在正常的純化步驟中，全能核酸酶作為雜質很容易被去除。為檢測全能核酸酶具體殘留量，行業內常采用UltraNuclease作為標準品，開發與之配套的ELISA試劑盒。

翌圣自主研發的UCF.ME® UltraNuclease ELISA Kit正是采用雙抗體夾心酶聯免疫檢測（夾心ELISA）原理，能夠準確檢測樣本中全能核酸酶的殘留量，該試劑盒在線性、重復性、回收率及特異性等方面均表現穩定。

圖5. 翌圣核酸酶ELISA試劑盒實驗原理（雙抗夾心ELISA法）

大多數應用于細胞基因治療的病毒載體均被設計為復制缺陷型。對于復制缺陷型病毒載體，在生產中可能發生經缺失改造的載體與野生型病毒序列之間的同源重組，導致產生復制型病毒，其中包括復制型慢病毒(RCL)、復制型逆轉錄病毒(RCR)和復制型腺相關病毒(rcAAV)。終產品中復制型病毒的存在有可能引起病人不良反應，構成臨床隱患和潛在危險，甚至引發腫瘤，故對復制型病毒檢測是安全性檢測中非常重要的項目。

隨著病毒載體在CGT領域應用越來越廣泛，相關法規和技術原則對監測復制型病毒提出了建議。

2022年CDE發布《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》和《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》都提到病毒載體制備工藝中，復制型病毒是安全性風險關注點之一，應采用經驗證的方法開展檢測，如指示細胞培養法、直接qPCR法等。

2020年1月28日，FDA發布的《關于細胞與基因治療申請(INDs)的化學、制造和控制(CMC)指導原則》中提到：對于生產過程中產生的RCA、RCR等，需要進行病毒收獲液、病毒原液、制劑等的檢測。

針對上述情況，翌圣生物自主研發了一系列復制型病毒（RCL/RCR/RCA/rcAAV）檢測試劑盒，基于熒光探針定量PCR原理，采用qPCR法特異性擴增對應復制型病毒的序列，專一快速的檢測各種使用病毒載體相關的細胞基因治療產品中可能發生的復制型病毒的潛在風險。

圖6.翌圣生物rcAAV-2復制型腺相關病毒檢測實驗流程

已知CAR-T和TCR-T細胞治療，均是將含有CAR或TCRαβ序列的目的基因構建到慢病毒或逆轉錄病毒載體中，然后進行病毒感染T細胞，獲得CAR-T或TCR-T細胞。這些載體基因整合在T細胞基因組中，一方面顯示有T細胞進行了CAR或TCR基因修飾，一方面又是一個安全性指標，可能會因整合而帶來原癌基因的激活或抑癌基因的失活等造成二次腫瘤的風險。盡管現在載體的設計已經大大降低了整合的風險，但這種風險仍未全消除，因此需要對整合到細胞基因組中的病毒載體拷貝數進行檢測。

針對CAR和TCR基因整合帶來的潛在風險，國內外的藥品監管相關機構都發布了相應的指導性文件。

2018年6月，中國食品藥品檢定研究院頒發的《CAR-T細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》明確規定CAR基因拷貝數≤5 copies/細胞。

目前，實時熒光定量PCR（qPCR）廣泛用于基因表達、拷貝數確定和病原體檢測研究等，這種方法可以準確定量樣品中DNA或RNA的核酸靶序列數量。因此，CAR和TCR等轉基因拷貝數的檢測行業內也普遍采用qPCR的方法。

翌圣生物自主研發了CAR/TCR基因拷貝數檢測試劑盒，采用多重熒光探針qPCR法分別檢測CAR-T或TCR-T細胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數以及人體細胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)。

相較于傳統化學藥物，以基因治療、細胞治療或組織工程為基礎的新型生物治療業已成為前沿性治療藥物。這些藥物大多以細胞為載體制備或構建，因此，在此過程中，對于細胞種子庫、病毒培養和收獲、臨床治療用途的細胞等生物制品中生產制備過程易受到支原體污染。

支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養的生物制品工藝過程，法規要求“必須確保無支原體污染"。目前國內外藥典推薦的支原體檢測方法主要是基于培養法、NAT(核酸擴增法)法、細胞培養指示法。

翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)是基于NAT法的一種快速定性檢測生產原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產品。該試劑盒基于定量PCR技術，使用Taqman熒光探針定性檢測待測樣本中支原體DNA，可覆蓋183種支原體DNA序列；并且嚴格按照EP 2.6.7和JP G3支原體檢測相關指南和要求進行驗證，具備靈敏度高、特異性好、安全性好等特點。該試劑盒還能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，通過手動提取或者使用自動化核酸提取儀自動提取樣本核酸，再由qPCR收集探針的熒光信號，從而對檢測結果進行判定。

圖7.翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測實驗流程