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本文介紹伴刀豆球蛋白A，及其與磁珠共價偶聯后的ConA磁珠的應用場景。
伴刀豆球蛋白A磁珠 （Concanavalin A-Coated Magnetic Beads，簡稱ConA磁珠），顧名思義，就是植物凝集素伴刀豆球蛋白A（ConA）和超順磁性納米材料進行偶聯的一種生物磁珠。下面將逐一介紹有關ConA磁珠的那些事兒。
伴刀豆蛋白A
伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A, ConA），是自1936年以來，第一個從刀豆（Canavalia ensiformis，洋刀豆）分離純化結晶的一種植物凝集素蛋白，無血型特異性。
ConA根據所處溶液pH值的不同，主要有2種形式：α-2 同源二聚體或 α-4 同源四聚體[2]。堿性條件下（pH>7.0）以四聚體（四個分子量為26kDa亞基構成）形式存在；酸性條件（pH 4.5-5.5）下，Con A解離為活化的二聚體結構（52kDa）。除此之外，ConA的功能受二價陽離子的影響，如在缺乏金屬離子（Ca2+ 和 Mn2+ ）的情況下，其構象、糖蛋白結合功能是無法得到發揮[1]。
圖1.ConA分子模型(A) ConA monomer, (B) ConA dimer, (C) ConA tetramer with mannose, glucose and metal ions
磁 珠
生物磁珠是一類具有納米粒徑大小，由高分子聚合物和無機磁性納米粒子形成的磁性微球。磁珠按照其結構可以分為三大類：核-殼型結構、夾層式結構、彌散型結構。磁性物質有純鐵粉、羰基鐵、磁性礦、正鐵酸鹽、鐵鈷合金等。
磁性納米材料，因其具備特殊的效應，如小尺寸效應、表面效應和量子尺寸效應等，在Fe3O4 納米顆粒的尺寸小于30 nm時, 納米顆粒內部熱騷動的干擾表現顯著, 此時, 這類納米顆粒就表現出一種特殊的磁學性質, 即超順磁性。超順磁性Fe3O4 納米顆粒具備優質的屬性，如無毒、良好的生物相容性、獨特的磁靶向特性以及在交變磁場中易于產熱等性質, 在生物行業中得到廣泛應用。
而將ConA與微球進行共價偶聯用于固定生物分子，則有以下優勢：
1. 共價偶聯結合穩定性高，便于重復；
2.配體ConA結合在微珠表面，可用于靶分子相互作用；
3.溶液環境的動力學特征，適合生物學實驗操作。
ConA磁珠的應用
根據文獻報導，ConA磁珠的主要應用分為3種場景，分別是進行細胞質膜分離、糖蛋白富集、和分離固定細胞方面。
利用ConA磁珠受二價陽離子的激活影響，使其存在于Ca2?和Mg2?溶液環境中，其具備的末端α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基的親和作用功能，用在質膜純化方面，是一種簡便、高效的方式。如細胞或組織的質膜分離，是進一步獲取質膜蛋白的關鍵步驟。而ConA是能結合細胞上糖基化蛋白，可利用此原理，獲取純度更高的質膜。主要操作步驟為：通過將生物素化的ConA與鏈霉親和素磁珠結合，將ConA固定在磁珠上；細胞膜與ConA磁珠孵育1h；磁力架上吸附；TBS洗滌5次；洗脫液洗脫細胞質膜溶液[3]。
圖2. ConA磁珠純化質膜步驟
ConA對甘露糖(mannose)和葡萄糖(glucose)具有特異性，且ConA識別α-連接甘露糖，這種甘露糖恰好是許多血清和細胞膜糖蛋白的“核心寡糖"。因此可用在免疫學等方面的分離細胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化分子。
主要操作步驟為：通過雙功能連接劑亞油酸雙- N-羥基琥珀酰亞胺酯 (DSS) 將氨基硅烷化的磁性納米微珠（ MNPs） 與ConA進行交聯，獲取ConA磁珠；使用甲氧基乙二醇（MEG）終止磁性納米微球的非特異性結合，進行磁分離；將加入用胰蛋白酶消化的細胞膜蛋白提取液，與ConA磁珠兩者孵育，磁力架收集已結合糖蛋白的ConA磁珠，洗滌非糖肽，最后洗脫捕獲的糖肽，進行真空干燥。通過該方法，可以對腫瘤相關蛋白 (如EGFR) 的特定糖基化位點進行深入分析[4]。
圖3. 超順磁性納米顆粒偶聯不同凝集素
利用ConA磁珠（磁珠與高純度的伴刀豆球蛋白A共價結合）與細胞膜或核膜上的糖蛋白結合，從而捕獲細胞或細胞核，可實現少量細胞的實驗操作可視化。如ConA磁珠用于用于研究染色質結構和功能的新型技術的CUT&Tag和CUT&RUN[5]實驗中，通過ConA磁珠與細胞結合固定，實現可視化操作，避免離心帶來的細胞丟失問題。
相對傳統研究DNA與蛋白互作的ChIP-seq技術，CUT&Tag和CUT&RUN具備以下優勢：
ConA磁珠與細胞膜糖蛋白結合，可視化操作，提升實驗操作體驗感；
無需離心，只需要ConA磁珠吸附在磁力架上，即可完成細胞樣本和溶液的分離；
可低至10個細胞的實驗操作，規避ChIP-seq的大量樣本的需求。
圖4. ChIP-seq，CUT&Tag，CUT RUN實驗流程示意圖
翌圣ConA磁珠
翌圣自研ConA磁珠，經過嚴格的原料篩選、多重工藝的優化和改善，能夠快速、高效、靈敏、特異性地與糖蛋白、糖脂、多糖等帶有糖基化修飾分子結合。主要用于分離細胞或用于分離細胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化修飾分子等實驗，特別直接用于CUT &RUN和CUT&Tag（ChIP-seq實驗的革新性技術）等實驗。
產品特點
細胞捕獲效率>90%；
穩定的批次生產和較好的結果重復性；
性能存放穩定。
產品信息
貨號 | Cat#19810ES |
規格 | 1mL/5mL/20mL |
顏色 | 棕黃色 |
磁珠濃度 | 10 mg/mL |
固含量 | 9-11 mg/mL |
磁珠尺寸大小 | 1 µm |
載量 | 105個細胞/μL磁珠 |
細胞捕獲 | 細胞捕獲率＞90% |
產品性能數據
單分散性
分別取競品和翌圣ConA磁珠以及翌圣裸球原料各10µL，相同處理條件下，放大倍數10×/40×鏡下，翌圣ConA磁珠基本呈單分散性，相對競品，未見明顯團聚。
ConA結合細胞效果
相同數量細胞與磁珠結合孵育相同時間，細胞分析儀下自動檢測ConA磁珠結合后剩余細胞數量，結果顯示翌圣ConA磁珠（Cat#19810）優于競品。
10µL翌圣ConA磁珠（Cat#19810）和10µL競品ConA磁珠，都可結合E7級別數量的細胞，與競品相當。重復操作下，細胞捕獲率>90%。
加速穩定性
按1 mL/管進行分裝。儲存條件分別為：4℃，37℃加速處理2天、4天、7天、11天和14天，-20℃破壞處理1天、3天、6天和8天。結果顯示同等實驗條件下：4℃保存產品、37℃加速處理和-20℃破壞處理的產品細胞捕獲率＞95%，各處理條件下，3組重復CV值在1%以內，重復性良好。
歡迎大家根據自己的實驗需要咨詢、選購！
產品訂購指南
產品名稱 | 產品編號 | |
CUT&Tag組合套裝 | Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 | 12597ES |
InStab™ Protease Cocktail,EDTA-free,mini,tablet-form 蛋白酶抑制劑Cocktail,EDTA-free,迷你型,片劑 | 20123ES | |
Goat Anti-Mosue lgG(H+L) 山羊抗鼠IgG | 34851ES | |
Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® | 12416ES | |
CUT&Tag單品 | pA-Tn5 Transposase (10 U/μL) | 14528ES |
pA-Tn5 Transposase (10 U/μL, without buffer) | 14529ES | |
pG-Tn5 Transposase (10 U/μL) | 14530ES | |
Nanobody-Tn5（anti-mouse & anti-rabbit） | 12595ES | |
Anti-rabbit Tn5 | 12594ES | |
Concanavalin A-Coated Magnetic Beads | 19810ES |
參考文獻：
[1].R A Bryce, I H Hillier, J H Naismith, Carbohydrate-protein recognition: molecular dynamics simulations and free energy analysis of oligosaccharide binding to concanavalin A. Biophys J. 81 (Sept. 2001): 1373-88. Abstract. PubMed. Web. 3 Sept. 2010.
[2].Chun-Yang Li, Huai-Long Xu, Bo Liu, Jin-Ku Bao, Concanavalin A, from an Old Protein to Novel Candidate Anti-Neoplastic Drug, Curr Mol Pharmacol. 2010 Nov;3(3):123-8.
[3].Yu-Chen Lee 1, Gregory Block, Huiwen Chen, et al, One-step isolation of plasma membrane proteins using magnetic beads with immobilized concanavalin A, Protein Expr Purif. 2008 Dec;62(2):223-9.
[4].Juanilita T Waniwan, Yi-Ju Chen, Rey Capangpangan, Glycoproteomic Alterations in Drug-resistant Non-small Cell Lung Cancer Cells Revealed by Lectin Magnetic Nanoprobe-based Mass Spectrometry, J Proteome Res. 2018 Nov 2;17(11):3761-3773.
[5].Hatice S Kaya-Okur, Derek H Janssens, Steven Henikoff, Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag, Nat Protoc. 2020 Oct;15(10):3264-3283.
