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腺相關病毒AAV簡介
早期基因治療曾嘗試腺病毒載體，但因其免疫原性過強和導入的環狀DNA可能在細胞分裂中丟失而被AAV取代。AAV是一種無包膜單鏈DNA病毒，屬于細小病毒家族。AAV作為最早通過歐盟FDA認證的基因治療載體，因其具有宿主范圍廣、非致病性、低免疫原性、長期穩定表達外源基因、良好的擴散性能和物理性質穩定等優點，已被廣泛地應用于基礎研究和臨床試驗中。
目前已發現AAV有12種亞型及120多種變型，并逐步用于基因藥物研發。rAAV攜帶的蛋白衣殼與野生型AAV幾乎相同，然而衣殼內的基因組中編碼病毒蛋白的部分被刪除，取而代之的是治療性轉基因（transgene）。
AAV基因組中被保留的部分是ITRs，它起到指導基因組的復制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白刪除，一方面可以重組AAV攜帶轉基因的容量，另一方面可以減小病毒載體的免疫原性和細胞毒性。
通常情況下AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時才能進行復制。
復制型腺相關病毒(rcAAV)概念及法規監管要求
在重組腺相關病毒(rAAV)載體生產過程中，轉染用質粒DNA與rAAV會由于物理接近而導致rAAV載體基因組、Rep/Cap基因以及ITR序列發生非同源重組，這些重組序列被誤包后就形成了具有復制能力的AAV，即復制型腺相關病毒(rcAAV)。
重組腺相關病毒載體收獲液、純化后的重組腺相關病毒原液、終產品等都可能有復制型腺相關病毒(rcAAV)的存在。rcAAV的存在可能不會引起rAAV產品的顯著安全性風險，但是會增強或干擾治療用rAAV 的作用效果或者導致rAAV載體基因序列的漂移 ，影響其基因組穩定性以及體內轉導效率等。因此，規模化生產過程中監測和產品放行時檢測rcAAV十分重要。
隨著病毒載體在CGT領域應用越來越廣泛，相關法規和技術原則對監測復制型病毒提出了建議。
CDE 2022年發布《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》和《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》都提到病毒載體制備工藝中，復制型病毒是安全性風險關注點之一，應采用經驗證的方法開展檢測，如指示細胞培養法、直接qPCR法等。
2020年11月歐洲的藥品監管機構EMA也發布了指南“Guideline on quality，non- clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells"，要求從病毒載體的設計上應盡可能降低與野生型病毒相關的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復突變的風險降到低，同時在產品的生產和應用的不同階段進行RCL等的控制，以保障患者的用藥安全。
2020年1月28日，FDA發布的《關于細胞與基因治療申請(INDs)的化學、制造和控制(CMC)指導原則》中提到：對于復制型腺相關病毒rcAAV的檢測，可以采用在輔助病毒存在的情況下擴增AAV，然后進行PCR檢測rep/ITR序列，以及在對載體制備進行DNase消化后進行PCR檢測rep和cap序列等。但該指導原則表明：不推薦用于檢測rcAAV的特定方法，藥企等應在IND中說明所用的檢測方法和檢測靈敏度。
復制型腺相關病毒(rcAAV)的檢測
中美歐三國監管機構對于復制型病毒的控制階段和檢測要求基本相同，在產品生產的各個階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續監測中進行檢測。并且各監管機構推薦的復制型病毒的檢測方法均是指示細胞培養法，該方法是復制型病毒檢測的金標準。
復制型腺相關病毒(rcAAV)的形成主要歸因于ITR中的同源序列和相鄰序列與rep/cap元件之間可能出現的重組事件。目前，rcAAV檢測常采用2種方法：基于細胞培養的檢測方法和qPCR快檢法（直接檢測法）。
FDA的指導原則建議通過全面的質量研究確認產品的關鍵質量屬性，由于下述rcAAV的兩種檢測方法各有優缺點，可考慮同時采用原理互補的不同方法進行研究。
基于細胞培養的檢測方法
通過不斷的細胞傳代使rcAAV實現擴增，之后再利用qPCR或Southern-blot方法進行檢測，保證檢測到的rcAAV都具有復制能力，是目前常用的檢測方法。
但是該方法也有它的缺陷：檢測靈敏度依賴于AAV不同血清型對靶細胞的感染效率，檢測值可能低于實際值；培養方法和檢測平臺建立也有難度，需建易感細胞株、輔助病毒庫等，耗時長且投入成本較高。
qPCR快檢法（直接檢測法）
對rAAV原液或終產品提取核酸后，直接利用qPCR法檢測rcAAV，靶標基因一般為ITR、Rep、Cap等的連接序列，可實現對rcAAV上兩種基因的檢測，提高準確性。
其缺點為：檢測片段短，不能保證檢測目標具備rcAAV復制所需完整序列，導致檢出的rcAAV不一定有復制能力，檢測值相較實際值偏高。
因此，針對rcAAV的檢測開發一款既能用于細胞培養后的終點檢測，也能用于rcAAV直接檢測的qPCR試劑盒，對于實現兩種檢測方法的互補驗證非常有必要。
針對上述情況，翌圣生物自主研發了復制型腺相關病毒血清型2 (rcAAV2)檢測試劑盒，基于熒光探針定量PCR原理，采用qPCR法分別檢測rAAV末端重復序列(ITR)（即參考基因Reference）和rcAAV的連接序列（即靶基因Target），實現對rAAV和rcAAV的同時定量檢測。還研發了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。用于定量分析檢測各種使用AAV2血清型的重組腺相關病毒載體進行基因治療、腫瘤治療及疫苗研發等產品中可能發生的復制型腺相關病毒(rcAAV)的潛在風險。
產品資質
符合法規：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗證，符合國際機構的標準；
配合審計：產品生產符合ISO13485質量體系標準，有完善的審計文件；
保障品質：試劑盒所需酶原料全自產，且已產業化，供貨穩定；
技術經驗積累：TaqMan法有技術沉淀，使得Kit靈敏度高；
專注產品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、穩定性等。
產品特點
抗干擾性：針對復雜基質，樣本加標回收率至少能達到70-130%；
靈敏度高：定量下限(LLOQ)為2copies/μL，檢測下限(LLOD)為0.125copies/μL；
精密度高：批內重復性高CV＜10%，批間差異小即中間精密度CV＜15%；
專屬性強：特異性檢測目的基因序列，不受其他外源基因組DNA干擾；
防干擾強：引入內部質控(IC)，可排除樣本干擾、反應配制異常等，避免假陰性。
驗證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗證指導原則，可提供完善的驗證報告。
驗證內容
rcAAV-2檢測驗證項目 | 參考標準or要求 | 備注 | |
1、試劑盒標準品（參考品） | 含有參考基因Reference和靶基因Target的質粒DNA | ||
2、線性范圍 | 標曲范圍 | 參考說明書或實際情況（Reference和Target均是2×101～2×106copies/μL） | |
R2 | ≥0.98（P.s.本試劑盒≥0.99） | 藥典要求 | |
斜率 | -3.1~-3.8（P.s.本試劑盒-3.1~-3.6） | 藥典要求 | |
擴增效率 | 90%~110%（P.s.對應的斜率-3.1~-3.6，行業內要求） | ||
3、準確性 | 回收率 | 50%~150%（P.s.本試劑盒70~130%） | 藥典要求 |
4、精密度 | 重復性 | CV＜10% | |
中間精密度 | CV＜15% | ||
5、專屬性 | 不受其他來源基因組DNA的干擾 | ||
6、靈敏度 | 定量限 | Reference和Target均是2copies/uL | |
檢測限 | Reference和Target均是0.125copies/uL | ||
7、耐用性 | 儀器適用性 | Thermo：ABI 7500、ABI QuantStudio5； Bio-Rad：CFX96 Optic Module； 上海宏石：SLAN-96S. | |
8、穩定性 | 加速穩定性 | 37℃穩定14天，2~8℃穩定30天 | |
反復凍融 | ≥10次 | ||
有效期 | -25~-15℃保存2年 | ||
9、空白限 | 無模板對照（NTC） | 重復48次qPCR擴增曲線CT≥40 | |
陰性抽提對照（NCS） | 重復48次qPCR擴增曲線CT≥40 | ||
產品信息
產品 | 貨號 | 品名 | 規格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18467ES | MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預封裝) | 3×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80511ES | 48通道自動化核酸提取儀 | 48通量 |
rcAAV-2檢測試劑盒 | 41327ES | Replication-competent AAV Serotype 2 (rcAAV2) Detection Kit 復制型腺相關病毒血清型2 (rcAAV2)檢測試劑盒 | 50T/100T |
