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N6-甲基腺苷（m6A）是高等真核生物信使RNA（mRNA）內部豐富的修飾，與人類的發育，免疫，腫瘤生成和轉移，干細胞更新，脂肪分化等過程息息相關，目前m6A甲基化修飾已成為科研中一個重要且熱門的研究方向，因此，開發m6A甲基化的檢測方法也尤為重要。
甲基化RNA免疫共沉淀高通量測序(MeRIP-seq/m6A-seq)是目前研究m6A甲基化修飾使用廣泛的技術之一。該技術利用特異性識別m6A甲基化修飾的抗體，對細胞內具有m6A甲基化修飾的RNA片段進行免疫共沉淀。然后，對沉淀下來的RNA片段進行高通量測序，并結合生物信息學分析，以在全基因組范圍內系統研究m6A甲基化修飾的情況。盡管MeRIP-seq是一種廣泛應用的技術，但因其受到輸入量、抗體特異性、交聯效率、非定量讀數等因素影響，MeRIP-seq很難實現對m6A甲基化修飾全轉錄組無偏好檢測和絕對定量。
圖1. MeRIP-seq/m6A-seq技術原理[1]
隨著技術的不斷進步和創新，有一種更加準確、可靠和高效的m6A甲基化修飾檢測技術出現了，即E. coli tRNA-specific adenosine deaminases（TadA）酶輔助的m6A測序技術（eTAM-seq）。
TadA是一種來源于大腸桿菌的腺嘌呤脫氨酶，自然界中野生型TadA可對單鏈RNA（ssRNA，主要是轉運RNA（tRNA）內的環區）或雙鏈RNA（dsRNA）的腺嘌呤脫氨，對DNA無脫氨活性。TadA可以在tRNAArg的單鏈反密碼子環中將A轉化為I，I在DNA的修復和復制過程中被讀為G。TadA經蛋白改造后重組表達而來的突變體，也可以用于ssDNA的腺嘌呤高效脫氨。
圖2. TadA作用原理圖
eTAM-seq
在《Nature Biotechnology》雜志上，芝加哥大學化學系的湯瑋欣教授、陳夢潔教授和何川教授共同發表了一篇名為“Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination"的文章。該研究報道了一種基于TadA酶輔助的m6A測序技術（eTAM-seq），利用了TadA酶的特性，能夠以單堿基分辨率對m6A進行準確的定量分析。相較于傳統方法，該方法能有效保持RNA樣本完整性，另外僅需要極少量的RNA樣本，便能夠實現對m6A甲基化修飾的精確檢測和定量分析，為表觀轉錄組破譯提供了新方法。
圖3. eTAM-seq測序原理[2]
eTAM-seq測序原理與實驗流程
eTAM-seq技術通過對未被甲基化修飾的A進行脫氨反應轉化成I，I能與C配對，在經過聚合酶鏈反應（PCR）反應后變為G，而甲基化修飾的m6A保留了其甲基化狀態，仍被檢測為A，從而識別出轉錄組中的m6A修飾。具體實驗流程如下：
poly A尾去除
將RNA與oligo-dT進行退火處理，使用RNase H特異性消化RNA的poly A尾。
RNA打斷、末修及3’接頭連接
對RNA進行片斷化處理，隨后使用T4 PNK進行末端修復，最后利用T4 RNA ligase 2在RNA3’端連接接頭。
TadA脫氨處理
未被甲基化修飾的A進行脫氨反應轉化成I，甲基化的A保持不變。
cDNA合成及5’接頭連接
將脫氨酶處理后的RNA與RT引物退火，利用MMLV逆轉錄酶合成cDNA，隨后利用T4 RNA ligase 1在cDNA的5’端連接接頭。
PCR擴增及測序
圖4. eTAM-seq實驗流程[2]
eTAM-seq技術的高準確性、穩定性以及單堿基分辨率等特性，使其在進一步優化并推廣至單細胞水平的檢測中具有巨大的潛力。但eTAM-seq的核心原料TadA目前無商業化產品，限制了其應用，翌圣緊跟科研前沿，借助翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor（點擊了解更多）酶改造及發酵、純化工藝平臺成功開發了TadA脫氨酶（Cat#14556ES），并可提供eTAM-seq的相關酶原料，助力新技術研發及轉化。經過多家頂尖工業與科研機構客戶驗證，本產品在eTAM-seq應用中展現出的性能表現。
eTAM-seq技術相關產品
流程 | 產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 |
Poly A去除 | RNase H | RNase H | 12906ES |
末端修復 | T4 PNK | T4 Polynucleotide kinase | 12902ES |
脫氨 | TadA脫氨酶 | E.coli tRNA adenosine deaminase (ecTadA) | 14556ES |
逆轉錄 | 逆轉錄酶 | Hifair® Ultra Reverse Transcriptase | 14604ES |
RNase抑制劑 | UCF.ME® High Affinity RNase Inhibitor | 14675ES | |
接頭連接 | RNA連接酶 | T4 RNA Ligase 1 | 14651ES |
PCR擴增 | 高保真擴增酶 | Hieff Canace®II High-Fidelity DNA Polymerase | 10140ES |
參考文獻
[1] Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023;4(3):100546.
[2] Xiao YL, Liu S, Ge R, et al. Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination. Nat Biotechnol. 2023;41(7):993-1003.
