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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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近些年，隨著生物醫藥迅猛發展、疫情下細胞基因治療以及mRNA疫苗的相繼涌現，如何把控生物制品安全可靠，成為各國法規政府重視以及監管的要點。支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養的生物制品工藝過程，法規要求“必須確保無支原體污染"。
監管機構要求的支原體檢測點
2020版中國藥典三部《生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制》中提出對于生產用細胞，需要對主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）、生產終末細胞（EOPC）進行支原體檢查；
《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中建議在關鍵時間點對適合的中間樣品開展支原體等安全性相關檢測或采取相關的措施加以控制，并且支原體同樣需要作為終產品的放行檢項；
FDA , Guidance for Industry : Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，中提出對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。
NAT法和傳統方法
在快速檢測方法（NAT，核酸擴增技術）出現之前，傳統的培養法和指示細胞法因其檢測周期長或靈敏度問題，致使企業生產或產品放行周期拉長或者需要基于風險評估對細胞原料進行條件放行或者尋求其他替代方法。而隨著細胞基因治療的發展，行業內對支原體檢測時效性和靈敏度要求越來越高，短的貨架期不足以支撐如此長的檢測周期，因此NAT方法從眾多支原體檢測方法中脫穎而出。
目前歐洲藥典（EP）<2.6.7>，日本藥典（JP）以及美國藥典（USP）<63>都已收錄NAT方法作為支原體檢測方法，但需要對該方法進行驗證以及與傳統方法進行對比其檢測靈敏度不低于傳統方法，才可以使用。2020版中國藥典（ChP）雖然并未收錄NAT法作為支原體檢測方法，但其中也提到了“也可采用經國家藥品檢定機構認可的其他方法"。2022年5月，國家藥監局藥審中心發布的《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中提到“當檢驗樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無法滿足，可考慮開發新型的無菌和支原體的檢測方法進行放行檢測，但是新型檢測方法應經過充分驗證"。所以NAT法有望作為能夠支持快速支原體放行檢測的方法，被越來越多的原材料供應商、以及ATMP企業所使用。
中外法規里列舉的支原體檢測方法
翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)是基于NAT (nucleic acid amplification techniques)的一種快速定性檢測生產原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產品。
該試劑盒基于定量PCR技術，采用多重PCR的方法，使用2種熒光探針，FAM和CY5，分別檢測目標序列和內參。相較40618ES貨號的支原體qPCR檢測試劑盒，該2G版本可覆蓋多達183種支原體DNA序列，所需待測樣本的模板量也減少了一半，還可兼容更多品牌的qPCR儀器。
同時，MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)也嚴格按照EP 2.6.7進行專屬性、檢測限、耐用性的全面驗證，檢測限滿足≤10 CFU/mL的要求。同時覆蓋USP、JP、WHO、ChP等中要求驗證的支原體菌株類型，試劑盒性能符合中外法規要求，助力生物醫藥客戶的藥物研發項目臨床實驗申請等的順利受理。
產品資質
符合法規：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗證，符合國際機構的標準；
配合審計：產品生產符合ISO13485質量體系標準，有完善的審計文件；
保障品質：試劑盒所需酶原料全自產，且已產業化，供貨穩定；
技術經驗積累：TaqMan法有技術沉淀，Kit靈敏度可達10CFU/mL及以下；
專注產品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、靈敏度、穩定性。
產品特點
檢測種類多：優化的TaqMan探針可檢測多達183種支原體；
操作簡便：樣本制備和檢測總時長<3h，無需培養法的28天等待；
靈敏度高：檢測限達到可以替代直接培養法的10CFU/mL；
專屬性強：針對16s rRNA設計引物探針，不與梭菌、乳桿菌等親緣關系物種交叉反應；
安全性高：試劑盒內陽性對照(PC)無感染性，全消除污染風險；
防干擾強：引入內部質控(IC)，可排除樣本干擾、反應配制異常等因素，有效避免假陰性。
完整解決方案
翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測
翌圣生物MycAway™支原體qPCR檢測試劑盒(探針法)能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，可以通過手動提取或者使用自動化核酸提取儀自動提取樣本核酸。樣本經過前處理去除干擾雜質獲得純化的支原體DNA后，通過qPCR收集探針的熒光信號，從而對檢測結果進行判定。
驗證內容
性能 | 驗證參數 | 試劑盒驗證結果 |
檢測限 | 支原體菌株檢測限 | 10種法規藥典要求的支原體10CFU/mL，分別檢測24次，檢出率≥95% |
專屬性 | 樣本基質干擾 | 檢測了9種樣本基質和DNA稀釋液，均未檢出支原體 |
交叉反應 | 檢測了14種菌株、6種生物醫藥常用工程細胞，均未檢出支原體 | |
耐用性 | 凍融穩定性 | 可經受反復20次凍融，試劑盒性能不受影響 |
熱加速穩定性 | 37℃條件下14天和4℃條件下30天，試劑盒性能不受影響 | |
儀器適用性 | 適用ABI7500、ABI QuantStudio™5、Bio-Rad CFX96、羅氏LightCycler®480 | |
覆蓋度 | 覆蓋支原體DNA種類 | 通過支原體16SrRNA序列進行數據庫比對，覆蓋183種柔膜菌綱物種 |
產品信息
產品 | 貨號 | 品名 | 規格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18467ES | MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預封裝) | 3×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80511ES | 48通道自動化核酸提取儀 | 48通量 |
支原體檢測 試劑盒 | 40619ES | MycAway® Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G) 支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)
| 25T/100T |
