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什么是樹突狀細(xì)胞（DC）？
DC細(xì)胞是“Dendritic Cell"，中文名稱是樹突狀細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞是人體內(nèi)有效的抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell, APC）。DC細(xì)胞是能夠顯著刺激初始T細(xì)胞增值的APC，其他種類的APC（如單核巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞等）僅能刺激已活化的或者記憶性的T細(xì)胞，因此DC細(xì)胞是適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中發(fā)揮著及其重要的作用。
DC 表面高表達(dá)MHC -I和MHC -II類分子，具有特異性表面標(biāo)志的細(xì)胞。其對抗原攝取，加工以及刺激T細(xì)胞使其激活，并最終決定T細(xì)胞的分化方向。
圖1.DC-T 細(xì)胞相互作用[1]
DC提供三個關(guān)鍵信號來激活初始 T 細(xì)胞并啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)：
首先
DC 表面 p-MHC 復(fù)合物被抗原特異性 T 細(xì)胞受體 (TCR) 識別。
其次
共刺激相互作用發(fā)生在 DC CD80/CD86 分子和 T 細(xì)胞 CD28 分子之間。T 細(xì)胞還可能表達(dá) CTLA-4 分子，該分子與 DC CD80/CD86 相互作用并傳遞抑制 T 細(xì)胞激活的信號。
最后
局部細(xì)胞因子的存在，活化的T 細(xì)胞可能最終分化為幾種特殊亞型之一。其中包括 Th1、Th2、Th17 和 Treg 譜系。Th1、Th2 和 Th17 構(gòu)成 T 細(xì)胞反應(yīng)的“激活"臂，Treg 細(xì)胞形成“抑制"臂。
IL-12 刺激 Th1 細(xì)胞分化，產(chǎn)生 IFN-g，這是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要激活劑，IL-4抑制Th1細(xì)胞的分化。IL-4促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化，Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，激活嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和B細(xì)胞以支持體液免疫和寄生蟲抵抗力。IFN-g 抑制 Th2 分化。Th17 細(xì)胞在 TGF-β和 IL-6 或 IL-21 存在的情況下發(fā)育。它們分泌 IL-17、IL-17F、IL-21 和 IL-22，在自身免疫組織炎癥和對細(xì)胞外細(xì)菌感染的抵抗力的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF-β的存在促進(jìn)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞的發(fā)育。p-MHC-TCR 或共刺激相互作用（可能通過未成熟 DC 的抗原呈遞發(fā)生）以及通過 DC 共抑制分子或 CTLA-4 激活傳遞抑制信號也可能誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞分化。IL-6 抑制Treg細(xì)胞發(fā)育。Tregs分泌IL-10和TGF-β來抑制免疫反應(yīng)。
DC的來源
DC細(xì)胞在體內(nèi)含量甚微, 從體內(nèi)直接分離出DC耗時而且細(xì)胞產(chǎn)量很低，這極大地限制了DC的研究和應(yīng)用。但DC能從不同組織里的DC前體細(xì)胞分化、誘導(dǎo)而來, 如骨髓液的前體細(xì)胞，外周血和臍帶血的單核細(xì)胞。
對于人，由于人外周血的取材最為方便且單核細(xì)胞數(shù)量最多，所以常用的方法是從人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)DC。而對于小鼠，最常見的方法是從骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生DC，即骨髓來源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。
DC分類
根據(jù)DC發(fā)育成熟狀態(tài)，分為不同成熟階段
Step1
從DC的祖細(xì)胞（如單核細(xì)胞）誘導(dǎo)分化為未成熟DC（immature DC，iDC）
Step2
從iDC誘導(dǎo)分化為成熟DC (mature DC，mDC)
圖2.DC細(xì)胞分類[2]
iDC和mDC的作用
DC的不同成熟狀態(tài)決定了其在免疫應(yīng)答中的作用，iDC具有很強(qiáng)的抗原攝取和加工能力。但抗原遞呈能力很弱，不能活化T細(xì)胞。在體外培養(yǎng)時，iDC 去除細(xì)胞因子(即 GM-CSF 和 IL-4)后，會逆轉(zhuǎn)為巨噬細(xì)胞。MHC -II類分子和共刺激分子CD80、CD86和CD40是DC成熟程度的指標(biāo)。未成熟的DC低表達(dá)MHC -II類分子和共刺激分子CD80、CD86和CD40等。
成熟DC則正好相反，其抗原攝取和加工能力很弱，但具有很強(qiáng)的抗原遞呈能力。因而可以激活 T 細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)。而且 DC 成熟后即使在培養(yǎng)體系中去除細(xì)胞因子，仍能保持 DC 的狀態(tài)和功能，不會發(fā)生逆轉(zhuǎn)。因此DC 必須成熟后才能用于免疫治療。
DC培養(yǎng)原理
人源DC的培養(yǎng)主要是由外周血單核細(xì)胞與不同的細(xì)胞因子組合進(jìn)行定向誘導(dǎo)產(chǎn)生。目前誘導(dǎo)DC產(chǎn)生的細(xì)胞因子組合有多種，如IL-4聯(lián)合GM-CSF、TNF-α聯(lián)合GM-CSF、IFN-α聯(lián)合GM- CSF、IL-15聯(lián)合GM-CSF、單獨TSLP進(jìn)行誘導(dǎo)等，由此產(chǎn)生的DC特性也各不相同。DC的前體細(xì)胞來源不同，采用的細(xì)胞因子組合也不盡相同。目前人源DC常用的方法是GM-CSF聯(lián)合IL-4誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生DC。
細(xì)胞因子的作用
GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC。TNF-α/IL-1β/IL-6 三因子組合可在無牛血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)DC的全成熟，從而制備出DC。
圖3. 人外周單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（MoDC）制備方法簡圖
Step1:
GM-CSF (粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子）
(1)GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落的形成，并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能；
(2)GM-CSF是常用的DC細(xì)胞培養(yǎng)因子之一；
(3)它能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞或DC前體細(xì)胞向DC分化，并促進(jìn)DC的增殖和存活；
(4)GM-CSF還可以提高DC表面抗原水平，增強(qiáng)DC的抗原捕獲和處理能力。
1. IL-4 (白細(xì)胞介素-4)
（1）單核細(xì)胞可分化為巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞 (OC) 和樹突狀細(xì)胞 (DC)。
（2）IL-4 抑制單核細(xì)胞向CD14+巨噬細(xì)胞分化，從而誘導(dǎo)其分化為未成熟DC。若培養(yǎng)體系中不加 IL-4，單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì)胞。
（3）IL-4能夠促使DC產(chǎn)生Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-10和IL-13。
（4）IL-4 還可影響DC的表面標(biāo)志物表達(dá)，使其具有更好的抗原遞呈和T細(xì)胞活化能力。
GM-CSF和IL-4 共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC，此時的DC具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá) MHC I 類、II 類分子和 B7 家族分子(CD80, CD86 等)，但不表達(dá)或低表達(dá)CD14。
Step2:
TNF-α (腫瘤壞死因子-α）
TNF-α是一種早期炎癥細(xì)胞因子，能夠促使DC的分化和成熟，并增強(qiáng)其抗原遞呈能力。它還能夠激活NF-κB信號通路，促進(jìn)DC產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子。
IL-1 (白介素-1)
(1)IL-1是一種早期炎癥細(xì)胞因子，包括IL-1α和IL-1β兩個亞型。
(2)在DC細(xì)胞培養(yǎng)中，IL-1β能夠促進(jìn)DC的分化和成熟。
(3)IL-1β刺激DC表達(dá)更多的共刺激分子（如CD40、CD80和CD86），增強(qiáng)其抗原遞呈和T細(xì)胞活化能力。
(4)此外，IL-1也可以促進(jìn)DC產(chǎn)生其他炎癥細(xì)胞因子，如IL-12和TNF-α等。
IL-6 (白介素-6)
(1)IL-6是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子。在DC細(xì)胞培養(yǎng)中，IL-6起著雙重作用。
(2)一方面，IL-6可以促進(jìn)DC的分化和成熟，提高其抗原遞呈能力。
(3)另一方面，IL-6還可以影響DC的功能，如調(diào)節(jié)其分泌的細(xì)胞因子類型和數(shù)量。
(4)IL-6還可以調(diào)控DC與其他免疫細(xì)胞之間的相互作用，如與T細(xì)胞的活化和極化。
這 3 種細(xì)胞因子均可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)MHC II類分子區(qū)室消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面 MHC I類、II 類分子和B7家族分子(CD80, CD86 等)的表達(dá)，使未成熟DC分化為成熟DC，此時DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可地激活 T細(xì)胞。TNF-α,IL-1β和IL-6三因子組合可在無牛血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo) DC 的成熟，從而制備出DC。
PGE2 (前列腺素 E2)
在 TNF-α，IL-1β、IL-6 成熟誘導(dǎo)組合中添加 PGE2，可進(jìn)一步提高 DC 的產(chǎn)量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力。DC 遷移能力的提高非常重要。因為TNF-α，IL-1β、IL-6 誘導(dǎo)成熟的DC遷移能力較弱，不能很好地到達(dá)淋巴結(jié)而激活T細(xì)胞。而添加PGE2后誘導(dǎo)成熟的DC因表面趨化因子受體的高表達(dá)，而更容易遷移至淋巴結(jié)，進(jìn)而引起機(jī)體對抗腫瘤的免疫反應(yīng)。
因此，TNF-α/IL-1β /IL-6/PGE2 組合廣泛應(yīng)用于臨床，并被認(rèn)為是制備成熟DC 的“金標(biāo)準(zhǔn)"。
各細(xì)胞因子使用濃度
請根據(jù)具體實驗?zāi)康?、?xì)胞類型和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定適合自己實驗需求的最佳濃度，表1中濃度僅供參考。
表1. 各細(xì)胞因子工作濃度
組分 | 工作濃度 |
Human GM-CSF | 500-1000 U/mL (50-100 ng/mL) |
Human IL-4 | 250-500 U/mL (50-100 ng/mL) |
Human TNF-α | 10 ng/mL |
Human IL-1β | 10 ng/mL |
Human IL-6 | 10-100 ng/mL |
PGE2 | 1 μg/mL |
人外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞（MoDC）的制備
外周血單核細(xì)胞的采集
1.1 用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個核細(xì)胞 80-100mL；
1.2 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個核細(xì)胞(PBMC)。
1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的 PBMC，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到（1-3）×108。
DC前體細(xì)胞培養(yǎng)
2.1 PBMC用培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106/mL，并接種于培養(yǎng)板中；
2.2 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h，吸棄培養(yǎng)上清，用培養(yǎng)基輕輕洗培養(yǎng)板以去除非貼壁細(xì)胞，即獲得貼壁的單核細(xì)胞；
2.3 在貼壁細(xì)胞中加入含重組人GM-CSF(500-1,000U/mL)和重組人 IL-4(500U/mL)的培養(yǎng)基，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC細(xì)胞分化；
2.4 每 2-3d 半量換液一次，并補(bǔ)足人 GM-CSF和IL-4；
2.5 在培養(yǎng)的第 6d，加入重組人 TNF-α(10-20 ng/mL)，IL-1β(10ng/mL)，IL-6(1000U/mL)和PGE2(1μg/mL)，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；
2.6 在培養(yǎng)的第 7d 或第 8d，收獲 DC 細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到 1×106 個以上；
DC 的質(zhì)檢
在培養(yǎng)過程中可進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞活力檢測。
3.1 活細(xì)胞比例：
臺盼藍(lán)染色驗證活細(xì)胞應(yīng)在 90%以上；
3.2 形態(tài)學(xué)觀察：
>90%細(xì)胞半懸浮，細(xì)胞有多個樹突樣突起；
3.3 細(xì)胞表型分析：
流式細(xì)胞術(shù)檢測 DC特異性表面標(biāo)志物， CD14、HLA-DR、HLA-ABC、CD40、CD80、CD83 和 CD86 等分子的表達(dá)，成熟的DC不表達(dá) CD14，而高表達(dá)其他分子。CD83 是成熟 DC 的特異性標(biāo)志，在單核細(xì)胞和不成熟DC 表面不表達(dá)或低表達(dá)。
3.4 無菌檢測：
收獲細(xì)胞前取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，均應(yīng)為陰性；
3.5 內(nèi)毒素檢測：
收獲細(xì)胞前取少量培養(yǎng)物，回輸前，用鱟試劑檢測內(nèi)毒素含量，標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素<0.5 EU/ml。
3.6 抗原吸收能力檢測：
使用dextran（葡聚糖）作為抗原，可以評估MoDC細(xì)胞的抗原吸收能力。收集單核細(xì)胞，不成熟DC和成熟DC，分別按1×105 cells/mL懸于全培養(yǎng)基，再加入FITC-dextran（1 mg/mL），在37°C下，孵育0、5、10、20、30和60分鐘。所有樣品在冰上保持60分鐘。60分鐘后，使用含有1%胎牛血清的冰PBS洗滌所有樣品兩次（以300×g離心，5分鐘，4°C），最后懸浮于含有0.5%BSA的PBS中。樣品保持在冰上直到流式細(xì)胞術(shù)分析。通過流式細(xì)胞術(shù)測量FITC的平均熒光強(qiáng)度（MFI）來測定FITC-dextran的攝取。
3.7 成熟MoDC的遷移能力
Transwell實驗：將mMo DC重懸于含有10%FCS的培養(yǎng)基中，密度5×105細(xì)胞/mL，取200µL在Transwell板的上部隔間中。下部隔室加滿600µL含有重組人CCL19的培養(yǎng)基，重組人CCL19配制梯度濃度，檢測不同濃度下 MoDC的遷移能力。3小時后，收獲下隔室中包含的細(xì)胞，并計數(shù)。
3.8 MoDC誘導(dǎo)混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（MLR）
iDC在攝入抗原后，逐漸成熟并遷移到T淋巴細(xì)胞區(qū)域，遞呈抗原刺激T細(xì)胞增殖引發(fā)免疫反應(yīng)。 準(zhǔn)備5×10? CD4+T細(xì)胞懸浮在400µL PBS中，并用熒光染料標(biāo)記T細(xì)胞。隨后，細(xì)胞清洗3次。最后，將CD4+T細(xì)胞懸浮在MLR中，密度為5×10? cells/mL。
懸浮單核細(xì)胞、imMo-DCs和mMo-DCs于MLR中,在密度為1×10? cells/mL，并根據(jù)表2連續(xù)稀釋。將不同的細(xì)胞稀釋液（每孔100µL）置于96孔板中。隨后，加入標(biāo)記的T細(xì)胞（每孔100µL），并在37℃、5% CO2下培養(yǎng)7天。CD4+T細(xì)胞的增殖通過測量流式細(xì)胞術(shù)檢測。
表2. Mo-DC/monocyte 連續(xù)稀釋
Mo-DC/monocyte density (cells/mL) | Number of Mo-DCs/monocytes per well | Ratio of Mo-DCs/monocytes to T cells |
2.5×105 | 25000 | 1:2 |
1.25×105 | 12500 | 1:4 |
6.25×104 | 6250 | 1:8 |
3.13×104 | 3125 | 1:16 |
1.56×104 | 1562 | 1:32 |
7.81×103 | 781 | 1:64 |
DC培養(yǎng)試劑推薦
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格(元） | 促價(元） |
Human GM-CSF | 91102ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3215/5145/14405 | 268/1608/2573/7203 |
Mouse GM-CSF | 91108ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3265/4985/13465 | 268/1633/2493/6733 |
Human IL-4 | 90105ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3215/5145/12865 | 268/1608/2573/6433 |
Mouse IL-4 | 90144ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3215/5144/14405 | 268/1608/2572/7203 |
Human TNF-α | 90601ES | 10μg/100μg/500μg | 815/2985/9985 | 408/1493/4993 |
Mouse TNF-α | 90621ES | 5μg/20μg/50μg/500μg | 535/1605/3695/5545 | 268/803/1848/2273 |
Human IL-1β | 90101ES | 2μg/10μg/50μg/100μg | 535/1855/5565/8905 | 268/928/2783/4453 |
Mouse?IL-1β | 90140ES | 2μg/10μg/50μg/100μg | 535/1855/3855/5785 | 268/928/1928/2893 |
Human IL-6 | 90107ES | 5μg/20μg/50μg/100μg | 585/1755/3165/4755 | 293/878/1583/2378 |
Mouse?IL-6 | 90146ES | 2μg/10μg/50μg/100μg | 535/1855/3855/5395 | 268/928/1928/2698 |
PGE2 | 60810ES03 | 1 mg | 545 | 436 |
產(chǎn)品特點
翌圣生物提供一系列與樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的HiActive®高活性細(xì)胞因子產(chǎn)品，以支持DC研究。
HiActive®高活性細(xì)胞因子: 每個細(xì)胞因子生物活性均經(jīng)過驗證，保證細(xì)胞因子的高活性。
活性驗證：
Human GM-CSF
Figure 4. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is less than 0.1 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 1.0 × 107IU/mg.
Human IL-4
Figure 5. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is less than 0.1 ng/mL,corresponding to a specific activity of >1 × 107 IU/mg.
Human IL-6
Figure 6. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is 0.23-0.48 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 2.0 × 106IU/mg.
相關(guān)文獻(xiàn):
1.Anna C. Filley1 and Mahua Dey. Dendritic cell based vaccination strategy: an evolving paradigm.J Neurooncol. 2017 Jun; 133(2): 223–235.
2.Emma Verheye,et. al. Dendritic Cell-Based Immunotherapy in Multiple Myeloma: Challenges, Opportunities, and Future Directions.International. Journal of Molecular. Sciences. 2022, 23(2), 904;
