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Smart-seq2:單個細胞以及微量細胞轉錄組建庫成功的保障

2024-4-22  閱讀(302)

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單細胞技術哪家強,翌圣生物來幫忙

 

單細胞技術介紹

單細胞測序技術,簡單來說,就是在單個細胞水平上,對基因組、轉錄組及表觀基因組水平進行測序分析的技術。傳統的測序,是在多細胞基礎上進行的,實際上得到的是一堆細胞中信號的均值,丟失了細胞異質性(細胞之間的差異)的信息。而單細胞測序技術能夠檢出混雜樣品測序所無法得到的異質性信息,從而很好的解決了這一問題。

 

單細胞技術類型

單細胞技術類型很多,有單細胞轉錄組、單細胞基因組、單細胞表觀組(單細胞ATAC、單細胞CUT&Tag、單細胞甲基化、單細胞Hi-C等)、單細胞蛋白組、單細胞代謝組等,各種技術不斷迭代,檢測靈敏度也不斷提升。

 

在眾多細胞技術中,應用廣泛的當屬單細胞轉錄組了。


單細胞轉錄組也分為低通量的smart-seq1/2/3和高通量的微流控和微孔板等研究。

 

今天我們要介紹的主角是Smart-seq2

 

單細胞技術類型

  • Smart-seq技術于2012年由Ramsk?ld團隊發表;

  • Smart-Seq2技術于2013年及2014年由Picelli團隊改進并發表;

  • Smart-seq3技術則于2020年由瑞典卡羅林斯卡學院的Rickard團隊進一步改進并發表。


雖然Smart-seq技術也迭代了多個版本,但是迄今為止,Smart-Seq2是使用最多且被廣泛認為更穩定的技術類型,也是國內市場眾多科技服務公司推崇的技術之一。

 

3.1

Smart-seq2技術原理

 

Smart-seq2關鍵技術原理有:

 
01
 

MMLVRT

使用的MMLV具有鏈置換活性和末端轉移酶活性。其在逆轉錄到達mRNA 5’端末端時,會在新合成的cDNA的3’末端多出幾個C堿基;

02
 

TSO引物序列

TSO引物的5’端含有1個通用引物序列,而在其3’端,有兩個核糖鳥苷(rG)和一個鎖核苷酸(LNA)修飾的鳥苷(G),可以促進模板轉換,進而擴增出完整的cDNA序列;

03
 
甜菜堿、海藻糖的添加

某些物種RNA中有發夾結構、環形結構等二級結構容易形成空間位阻影響逆轉錄酶結合,添加甜菜堿和海藻糖能在一定程度上增加酶的熱穩定性,同時破壞RNA的空間位阻。同時,甜菜堿和Mg2+同時存在,能在一定程度上提高cDNA產量。

 

3.2

Smart-seq2技術流程

 

 

3.3

Smart-seq2單細胞分離方法

 

單細胞分離方法很多,有梯度稀釋法、口吸管移液法、自動顯微操作法、顯微切割法、流式分選法等,不同的方法對比如下:

 

方法

描述

優點

缺點

梯度稀釋法

梯度稀釋細胞懸液至每孔一個細胞

方法簡單,無需專業設備

耗時,分離得到的細胞可能是多個細胞

口吸管移液法

使用玻璃毛細管分離單細胞

方法簡單

操作困難,具有隨機行

自動顯微操作法

使用自動微量移液管分離單細胞

可在位置放置細胞

需要專業設備

激光顯微切割

使用激光從組織切片中分離單細胞

保留了空間關系

技術上有難度,有潛在UV損傷

FACS

使用電荷分離含有單細胞的微滴

根據細胞大小、形態、內部復雜性和蛋白表達(通過抗體標記)準確篩選細胞類型

需要昂貴的專業設備,細胞處于高壓條件下

 

3.4

Smart-seq2技術與其他單細胞技術對比

 

單細胞技術除了Smart-seq、Smart-seq2和Smart-seq3之外,還有CEL-seq2/C1、Drop-seq、MARS-seq、SCRBseq。文章Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol Cell. 2017;65(4):631-643.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.01.023從不同角度來對單細胞技術進行評估,綜合來看,Smart-seq2更勝。

 

 

測序質量對比

 
 

圖.不同單細胞技術的測序質量對比

 

六種測序方法都有比較好的測序質量,均超過 50% 的數據成功被 mapping到。另外,可以明顯發現基于全長測序方案的 Smart-seq 較 UMI,外顯子區域的 reads 更多,其中 smart-seq2 有 48% 的 reads 比對到外顯子區域(如下圖)。這表明 Smart-seq2(48% reads 比對到外顯子)和 Smart-seq(30% reads 比對到外顯子)較 UMI 方案(均低于 15% reads 比對到外顯子)有更好的測序質量。

 

 

基因檢測效率對比

 
 

圖.不同單細胞技術測序深度和基因檢出數對比

采用抽樣的飽和度分析對測序深度進行評估,當測序深度達到 100 萬reads時,這六種測序方法均可達到飽和,但明顯 Smart-seq2 具有更好的基因檢測效率。

 

 

單個細胞進行實驗時的敏感度對比

 
 

圖.不同單細胞技術基因檢出情況對比

 

在相同的單個細胞進行單細胞建庫,相同的測序深度下,檢測單細胞中基因表達數量。結果發現,Smart-seq2 敏感度最好,達到中位數 9138/cell,而低的是 Drop-seq 和 MARS-seq,分別約為 4811/cell 和 4763/cell。

 

 

多個細胞進行實驗時的敏感度對比

 
 

圖.不同數量的細胞進行微量細胞建庫時基因檢出情況對比

 

多個細胞建庫后的reads合在一起進行生信分析,結果發現,Smart-seq2 仍然具有更多的基因被檢測到,MARS-seq 仍然具有最少的基因被檢測到,這與單細胞敏感度檢測是一致的。

 

 

單細胞建庫結果重復性對比

 
 

圖.不同單細胞技術建庫后的相關性分析

 

利用 92 個已知的外源 ERCC 轉錄本,進一步采用線性模型擬合了觀測的表達值與已知濃度的相關系數(R2)。通過分析發現,這六種方法的相關系數都較高,都高于 0.80 的相關系數。這表明這六種方法的準確度都較好,但 Smart-seq2 的相關系數為 0.91,而 MARS-seq 相關系數為 0.83。

 

 

不同單細胞技術的Drop out對比

 
 

圖.不同單細胞技術Drop out結果對比

 

對至少 65 個單細胞分析中發現,13361 個基因在 25% 的細胞中至少被一種方法檢測到表達,那么挑選這些基因進行分析,MARS-seq 具有最高的 drop out 中位概率(74%),而 Smart-seq2 (26%),此時說明 Smart-seq2 具有更好的敏感度,這與之前的敏感度也是對應的。

 

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