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在上期的“基因編輯探秘系列之原理篇"中，小翌已經詳細介紹了CRISPR系統的分類、機制和原理。本篇文章將為大家介紹CRISPR技術的生物形式和遞送技術。
CRISPR技術的生物形式
為了實現基因組編輯，CRISPR/Cas系統的組件需要進入靶細胞的細胞核中發揮作用，可以通過遞送不同形式的Cas和向導RNA（gRNA）來實現，包括質粒DNA（pDNA），mRNA或Cas核糖核蛋白（RNP）三種生物形式。
pDNA形式
pDNA通常被用作非病毒DNA傳遞的載體，其介導的CRISPR技術是將Cas9蛋白和gRNA的基因序列融入單個或多個pDNA載體之中。因pDNA具有易構建、操作簡便以及成本效益高等優點，成為了備受矚目的基因編輯方法。目前廣泛應用的Cas9質粒包含兩個表達盒，一個是密碼子優化的Cas9，一個是嵌合的gRNA。與我們細胞內遺傳信息的流動一致，含有CRISPR系統元件的pDNA需先進入細胞核，隨后轉錄成相應的mRNA，最后被轉移到細胞質中以啟動后續的蛋白質合成過程。
mRNA形式
mRNA介導的CRISPR基因編輯技術，其核心在于將Cas9 mRNA與gRNA共同精準地遞送至靶細胞。相較于傳統的pDNA轉染方式，mRNA的遞送方式能夠更為迅速地啟動蛋白質表達過程。與pDNA的應用策略不同，基于mRNA的編輯策略要求同時遞送Cas9 mRNA和gRNA這兩種關鍵的組分。Cas9 mRNA的制備主要依賴于體外轉錄（IVT）技術，并經過加帽和加尾修飾，以確保其穩定性和翻譯效率。gRNA作為另一重要組件，存在雙鏈和單鏈兩種形式。雙鏈形式的gRNA由crRNA和tracrRNA共同構成，這兩部分需要通過退火過程形成穩定的復合物。在實際應用中，可以通過化學合成的方式分別制備crRNA和tracrRNA，進而組裝成完整的雙鏈gRNA。而單鏈形式的gRNA則是將crRNA和tracrRNA巧妙地融合成一個單一的分子，無需退火過程。單鏈gRNA可以通IVT或化學合成的方式獲得，兩種方法各有利弊，可根據實驗需求進行靈活選擇。
IVT作為一種廣泛應用的gRNA生產方法，因其成本效益高、產量大以及操作簡便等優點，在實驗室中得到了廣泛的推廣和應用。化學合成gRNA是利用高通量化學合成平臺來完成的，通過在gRNA的5’和3’端各加入3個硫代和甲氧基修飾，不僅可以提高gRNA的穩定性，還能有效降低脫靶效應，從而提高基因編輯的精確性和安全性。
RNP形式
在CRISPR/Cas系統的應用中，直接遞送Cas9蛋白與gRNA，從而繞過pDNA或mRNA在細胞內部的轉錄與翻譯過程，無疑是實現高效基因編輯的優選方法。這種基于蛋白的遞送方式同樣依賴于兩個核心成分：Cas9核酸酶與gRNA，首先將Cas9蛋白與gRNA結合，形成帶有負電荷的Cas9/gRNA核糖核蛋白（Cas9 RNP）復合物，隨后將Cas9 RNP作為單一組分進行遞送。這種技術不僅簡化了操作過程，更提高了基因編輯的效率和準確性。
圖1. CRISPR-Cas9的三種生物形式[1]
三種生物形式的差異
每種CRISPR系統的生物形式都有的物理、化學、生理特性。
穩定性
Cas9 pDNA表現出最高的穩定性，相比之下，mRNA的穩定性較差，可通過對其核苷酸進行化學修飾提升mRNA的穩定性。Cas9 RNP由蛋白質和gRNA組成，其結構使得它容易受到蛋白酶和RNases的降解，因此是最不穩定的形式。
遞送方式
當Cas9的pDNA進入細胞后，它需經過轉錄和翻譯的過程，最終產生Cas9蛋白。而Cas9的mRNA則更為直接，僅需被傳遞至細胞質中，便可啟動翻譯過程生成Cas9蛋白。隨后Cas9蛋白與gRNA組裝為復合體發揮編輯作用。相較之下，RNP形式能夠直接入核進行編輯，無需經歷上述復雜的轉錄和翻譯過程。因此，遞送Cas9 RNP成為了細胞基因組編輯中最為直接且高效的策略，通常也被認為是最為理想的編輯方法。
脫靶風險
在基因組編輯應用中，CRISPR/Cas復合物僅在基因組修飾發生期間暫時需要，其在細胞中過度存在會增加脫靶事件的風險。Cas9 RNP和mRNA在細胞內的存在時間相對較短，有助于降低脫靶效應的潛在風險。而Cas9 pDNA能夠介導更長時間的基因表達，可能會增加脫靶編輯事件發生的風險。
Cas蛋白尺寸
由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于遞送基因編輯器到體內的AAV系統的包裝上限約為4.7 kb，因此尋找更小的基因編輯系統對于其高效體內遞送具有重要意義。目前不同的Cas系統均有小型Cas蛋白被開發，如Cas9系統中來自金黃色釀膿葡萄球菌中的SaCas9（1000多個氨基酸）；Cas12系統中的AaCas12b和BhCas12b（1100多個氨基酸）；Cas14(又稱Cas12f1，500個氨基酸) 、Cas12j（又稱CasΦ，700氨基酸）；Cas13系統中的Cas13bt（~800氨基酸），基因編輯已進入迷你時代。
CRISPR/Cas系統常見的三種應用模式pDNA、mRNA和RNP各有優缺點。從張鋒、劉如謙的最新發文來看，未來RNP形式的蛋白遞送或將成為繼mRNA之后的下一個焦點。
表1.CRISPRs生物形式對比
CRISPR系統的三種遞送技術
CRISPR系統的生物形式各異，因此其遞送方法也呈現出多樣性。目前，CRISPR/Cas9系統的遞送策略已發展出多種方法，主要分為三大類別：生物遞送方法、化學遞送方法以及物理遞送方法。
在生物遞送方法中，常利用腺相關病毒（AAV）載體、慢病毒載體等作為傳遞CRISPR/Cas9系統的媒介，這些載體具有生物相容性好、轉染效率高等優點，被廣泛應用于基因編輯領域。
化學遞送方法則主要依賴脂質納米顆粒（LNP）等納米材料作為載體，它們能夠高效地封裝CRISPR/Cas9系統并將其遞送至細胞內，同時具有較高的靶向性和生物安全性。
物理遞送方法則包括電穿孔、顯微注射等技術，這些方法通過物理手段將CRISPR/Cas9系統直接導入細胞內部，雖然操作復雜且對細胞損傷較大，但在某些特定應用場景下仍具有的優勢。
圖2. CRISPR技術不同的遞送方式[2]
病毒載體
在CRISPR-Cas9系統中，病毒載體扮演著至關重要的角色。其中，AAV、慢病毒以及桿狀病毒載體都是常用的遞送工具。值得一提的是，AAV已經成為體內基因治療領域廣泛應用的遞送載體，并成功獲得批準，遞送CRISPR組件至人體用于疾病治療。
AAV之所以備受青睞，源于它能夠輕易地跨越物種屏障感染細胞，同時其免疫原性極低，大大降低了引發炎癥反應的風險。然而，任何事物都有其局限性，AAV載體的最大包裝容量僅為4.7kb，這對于體積龐大的CRISPR/Cas9基因編輯系統來說，無疑是一個巨大的挑戰。尤其是當Cas9蛋白攜帶效應蛋白時，更是需要采取特殊的修改措施，如使用體積較小的SaCas9或將遞送系統分割為兩個載體，才能實現在AAV載體中的有效加載。
慢病毒作為能感染分裂和非分裂細胞的逆轉錄病毒，也常用作遞送載體。由于慢病毒的10kb負載能力，整個CRISPR/Cas9系統都可以加載到其中，但慢病毒隨機整合入宿主基因組可能引發免疫反應，甚至致癌。
脂質納米顆粒（LNP）
盡管病毒載體遞送系統已將CRISPR技術應用于臨床，但其療效仍受限于多重因素，如患者免疫反應、載荷大小限制、重復給藥難度及長期基因表達等問題。因此，科研人員正積極探索新的遞送策略，其中LNP-mRNA等非病毒系統備受矚目。
脂質載體是一種很有前景的CRISPR-Cas9系統遞送載體，通常由四種脂類組成：陽離子型（或電離型）脂類、聚乙二醇脂類、輔助磷脂和膽固醇。LNP的核心技術在于其具有pH依賴性的陽離子化脂質。在遞送階段，這種脂質能夠在中性pH環境下保持中性狀態，與周圍的成分和諧共處。然而，一旦進入酸性環境，如細胞內的內體，它便會迅速轉變為陽離子狀態。這種電荷狀態的轉變不僅能夠誘導粒子解離，還能夠破壞核內體膜，從而大大增強其從核內體逃逸的能力。這種機制不僅提高了遞送效率，還有效地降低了全身毒性，使得LNP成為一種安全且高效的遞送工具。
目前，已有多款基于LNP-RNA的療法成功獲得FDA的批準，這充分證明了LNP技術在實際應用中的可行性和有效性。
圖3. LNP組成[2]
新興遞送系統
盡管LNP在臨床實踐中已展現出作為基因編輯納米顆粒遞送系統的先進性，然而，眾多其他類型的納米載體同樣具備潛力，可巧妙地設計以進入細胞內部。例如，聚合物納米顆粒、蛋白質衣殼遞送系統以及類病毒顆粒（VLP）等，均為這一領域的研究者提供了新的遞送策略。
在本文中，我們向您介紹了CRISPR/Cas系統的三種生物形式及遞送方法，這些基礎知識鋪墊了對CRISPR技術的理解，為我們了解其在廣泛領域應用奠定了基礎。請繼續關注我們的系列文章，在接下來的文章中，我們將帶您了解CRISPR/Cas技術在細胞基因治療、農業等不同領域中的應用，更多精彩內容，不容錯過，敬請期待！
Cas RNP相關產品
產品分類 | 產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 |
Cas9蛋白 | spCas9含核定位信號 | Cas9 Nuclease | 14701ES |
spCas9+EGFP標簽 | NLS-Cas9-EGFP Nuclease | 11364ES | |
dCas9，無切割活性 | dCas9 Nuclease | 11351ES | |
Cas12a蛋白 | Agathobacter rectalis細菌來源 | ArCas12a Nuclease | 14702ES |
氨基酸球菌來源 | Ascpf1(Cas12) Nuclease | 11352ES | |
新兇手弗朗西斯菌來源 | Fncpf1(Cas12) Nuclease | 11353ES | |
螺科菌來源 | Lbcpf1（Cas12） Nuclease | 11354ES | |
Cas12b蛋白 | 嗜酸耐熱菌來源 | AapCas12b Nuclease | 14808ES |
sgRNA合成 | 體外轉錄合成sgRNA | Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES |
參考文獻：
[1] Yi Lin, Ernst Wagner and Ulrich L?chelt, Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP, Biomater. Sci., 2022, 10, 1166–1192
[2] Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. J Control Release. 2022;342:345-361.
