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干貨 │ 基因編輯探秘系列之技術篇

2024-4-22  閱讀(343)

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在上期的“基因編輯探秘系列之原理篇"中,小翌已經詳細介紹了CRISPR系統的分類、機制和原理。本篇文章將為大家介紹CRISPR技術的生物形式和遞送技術。


 

 

CRISPR技術的生物形式

 

為了實現基因組編輯,CRISPR/Cas系統的組件需要進入靶細胞的細胞核中發揮作用,可以通過遞送不同形式的Cas和向導RNA(gRNA)來實現,包括質粒DNA(pDNA),mRNA或Cas核糖核蛋白(RNP)三種生物形式。

 

01

pDNA形式

pDNA通常被用作非病毒DNA傳遞的載體,其介導的CRISPR技術是將Cas9蛋白和gRNA的基因序列融入單個或多個pDNA載體之中。因pDNA具有易構建、操作簡便以及成本效益高等優點,成為了備受矚目的基因編輯方法。目前廣泛應用的Cas9質粒包含兩個表達盒,一個是密碼子優化的Cas9,一個是嵌合的gRNA。與我們細胞內遺傳信息的流動一致,含有CRISPR系統元件的pDNA需先進入細胞核,隨后轉錄成相應的mRNA,最后被轉移到細胞質中以啟動后續的蛋白質合成過程。

 

02

mRNA形式

mRNA介導的CRISPR基因編輯技術,其核心在于將Cas9 mRNA與gRNA共同精準地遞送至靶細胞。相較于傳統的pDNA轉染方式,mRNA的遞送方式能夠更為迅速地啟動蛋白質表達過程。與pDNA的應用策略不同,基于mRNA的編輯策略要求同時遞送Cas9 mRNA和gRNA這兩種關鍵的組分。Cas9 mRNA的制備主要依賴于體外轉錄(IVT)技術,并經過加帽和加尾修飾,以確保其穩定性和翻譯效率。gRNA作為另一重要組件,存在雙鏈和單鏈兩種形式。雙鏈形式的gRNA由crRNA和tracrRNA共同構成,這兩部分需要通過退火過程形成穩定的復合物。在實際應用中,可以通過化學合成的方式分別制備crRNA和tracrRNA,進而組裝成完整的雙鏈gRNA。而單鏈形式的gRNA則是將crRNA和tracrRNA巧妙地融合成一個單一的分子,無需退火過程。單鏈gRNA可以通IVT或化學合成的方式獲得,兩種方法各有利弊,可根據實驗需求進行靈活選擇。

 

IVT作為一種廣泛應用的gRNA生產方法,因其成本效益高、產量大以及操作簡便等優點,在實驗室中得到了廣泛的推廣和應用。化學合成gRNA是利用高通量化學合成平臺來完成的,通過在gRNA的5’和3’端各加入3個硫代和甲氧基修飾,不僅可以提高gRNA的穩定性,還能有效降低脫靶效應,從而提高基因編輯的精確性和安全性。

03

RNP形式

在CRISPR/Cas系統的應用中,直接遞送Cas9蛋白與gRNA,從而繞過pDNA或mRNA在細胞內部的轉錄與翻譯過程,無疑是實現高效基因編輯的優選方法。這種基于蛋白的遞送方式同樣依賴于兩個核心成分:Cas9核酸酶與gRNA,首先將Cas9蛋白與gRNA結合,形成帶有負電荷的Cas9/gRNA核糖核蛋白(Cas9 RNP)復合物,隨后將Cas9 RNP作為單一組分進行遞送。這種技術不僅簡化了操作過程,更提高了基因編輯的效率和準確性。

 

圖1. CRISPR-Cas9的三種生物形式[1]

 

 

 

三種生物形式的差異

每種CRISPR系統的生物形式都有的物理、化學、生理特性。

 

01

穩定性

Cas9 pDNA表現出最高的穩定性,相比之下,mRNA的穩定性較差,可通過對其核苷酸進行化學修飾提升mRNA的穩定性。Cas9 RNP由蛋白質和gRNA組成,其結構使得它容易受到蛋白酶和RNases的降解,因此是最不穩定的形式。

 

02

遞送方式

當Cas9的pDNA進入細胞后,它需經過轉錄和翻譯的過程,最終產生Cas9蛋白。而Cas9的mRNA則更為直接,僅需被傳遞至細胞質中,便可啟動翻譯過程生成Cas9蛋白。隨后Cas9蛋白與gRNA組裝為復合體發揮編輯作用。相較之下,RNP形式能夠直接入核進行編輯,無需經歷上述復雜的轉錄和翻譯過程。因此,遞送Cas9 RNP成為了細胞基因組編輯中最為直接且高效的策略,通常也被認為是最為理想的編輯方法。

 

03

脫靶風險

在基因組編輯應用中,CRISPR/Cas復合物僅在基因組修飾發生期間暫時需要,其在細胞中過度存在會增加脫靶事件的風險。Cas9 RNP和mRNA在細胞內的存在時間相對較短,有助于降低脫靶效應的潛在風險。而Cas9 pDNA能夠介導更長時間的基因表達,可能會增加脫靶編輯事件發生的風險。

 

04

Cas蛋白尺寸

由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于遞送基因編輯器到體內的AAV系統的包裝上限約為4.7 kb,因此尋找更小的基因編輯系統對于其高效體內遞送具有重要意義。目前不同的Cas系統均有小型Cas蛋白被開發,如Cas9系統中來自金黃色釀膿葡萄球菌中的SaCas9(1000多個氨基酸);Cas12系統中的AaCas12b和BhCas12b(1100多個氨基酸);Cas14(又稱Cas12f1,500個氨基酸) 、Cas12j(又稱CasΦ,700氨基酸);Cas13系統中的Cas13bt(~800氨基酸),基因編輯已進入迷你時代。

 

CRISPR/Cas系統常見的三種應用模式pDNA、mRNA和RNP各有優缺點。從張鋒、劉如謙的最新發文來看,未來RNP形式的蛋白遞送或將成為繼mRNA之后的下一個焦點。

 

表1.CRISPRs生物形式對比

 

 

CRISPR系統的三種遞送技術

CRISPR系統的生物形式各異,因此其遞送方法也呈現出多樣性。目前,CRISPR/Cas9系統的遞送策略已發展出多種方法,主要分為三大類別:生物遞送方法、化學遞送方法以及物理遞送方法。

 

在生物遞送方法中,常利用腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體等作為傳遞CRISPR/Cas9系統的媒介,這些載體具有生物相容性好、轉染效率高等優點,被廣泛應用于基因編輯領域。

 

化學遞送方法則主要依賴脂質納米顆粒(LNP)等納米材料作為載體,它們能夠高效地封裝CRISPR/Cas9系統并將其遞送至細胞內,同時具有較高的靶向性和生物安全性。

 

物理遞送方法則包括電穿孔、顯微注射等技術,這些方法通過物理手段將CRISPR/Cas9系統直接導入細胞內部,雖然操作復雜且對細胞損傷較大,但在某些特定應用場景下仍具有的優勢。

2. CRISPR技術不同的遞送方式[2]

 

01

病毒載體

在CRISPR-Cas9系統中,病毒載體扮演著至關重要的角色。其中,AAV、慢病毒以及桿狀病毒載體都是常用的遞送工具。值得一提的是,AAV已經成為體內基因治療領域廣泛應用的遞送載體,并成功獲得批準,遞送CRISPR組件至人體用于疾病治療。

 

AAV之所以備受青睞,源于它能夠輕易地跨越物種屏障感染細胞,同時其免疫原性極低,大大降低了引發炎癥反應的風險。然而,任何事物都有其局限性,AAV載體的最大包裝容量僅為4.7kb,這對于體積龐大的CRISPR/Cas9基因編輯系統來說,無疑是一個巨大的挑戰。尤其是當Cas9蛋白攜帶效應蛋白時,更是需要采取特殊的修改措施,如使用體積較小的SaCas9或將遞送系統分割為兩個載體,才能實現在AAV載體中的有效加載。

 

慢病毒作為能感染分裂和非分裂細胞的逆轉錄病毒,也常用作遞送載體。由于慢病毒的10kb負載能力,整個CRISPR/Cas9系統都可以加載到其中,但慢病毒隨機整合入宿主基因組可能引發免疫反應,甚至致癌。

 

02

脂質納米顆粒(LNP)

盡管病毒載體遞送系統已將CRISPR技術應用于臨床,但其療效仍受限于多重因素,如患者免疫反應、載荷大小限制、重復給藥難度及長期基因表達等問題。因此,科研人員正積極探索新的遞送策略,其中LNP-mRNA等非病毒系統備受矚目。

 

脂質載體是一種很有前景的CRISPR-Cas9系統遞送載體,通常由四種脂類組成:陽離子型(或電離型)脂類、聚乙二醇脂類、輔助磷脂和膽固醇。LNP的核心技術在于其具有pH依賴性的陽離子化脂質。在遞送階段,這種脂質能夠在中性pH環境下保持中性狀態,與周圍的成分和諧共處。然而,一旦進入酸性環境,如細胞內的內體,它便會迅速轉變為陽離子狀態。這種電荷狀態的轉變不僅能夠誘導粒子解離,還能夠破壞核內體膜,從而大大增強其從核內體逃逸的能力。這種機制不僅提高了遞送效率,還有效地降低了全身毒性,使得LNP成為一種安全且高效的遞送工具。

 

目前,已有多款基于LNP-RNA的療法成功獲得FDA的批準,這充分證明了LNP技術在實際應用中的可行性和有效性。

 

圖3. LNP組成[2]

 

03

新興遞送系統

盡管LNP在臨床實踐中已展現出作為基因編輯納米顆粒遞送系統的先進性,然而,眾多其他類型的納米載體同樣具備潛力,可巧妙地設計以進入細胞內部。例如,聚合物納米顆粒、蛋白質衣殼遞送系統以及類病毒顆粒(VLP)等,均為這一領域的研究者提供了新的遞送策略。

 

在本文中,我們向您介紹了CRISPR/Cas系統的三種生物形式及遞送方法,這些基礎知識鋪墊了對CRISPR技術的理解,為我們了解其在廣泛領域應用奠定了基礎。請繼續關注我們的系列文章,在接下來的文章中,我們將帶您了解CRISPR/Cas技術在細胞基因治療、農業等不同領域中的應用,更多精彩內容,不容錯過,敬請期待!

 

 

 

Cas RNP相關產品

 

產品分類

產品定位

產品名稱

產品貨號

Cas9蛋白

spCas9含核定位信號

Cas9 Nuclease

14701ES

spCas9+EGFP標簽

NLS-Cas9-EGFP Nuclease

11364ES

dCas9,無切割活性

dCas9 Nuclease

11351ES

Cas12a蛋白

Agathobacter rectalis細菌來源

ArCas12a Nuclease

14702ES

氨基酸球菌來源

Ascpf1(Cas12) Nuclease

11352ES

新兇手弗朗西斯菌來源

Fncpf1(Cas12) Nuclease

11353ES

螺科菌來源

Lbcpf1(Cas12) Nuclease

11354ES

Cas12b蛋白

嗜酸耐熱菌來源

AapCas12b Nuclease

14808ES

sgRNA合成

體外轉錄合成sgRNA

Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit

11355ES

 

 

參考文獻:

[1] Yi Lin, Ernst Wagner and Ulrich L?chelt, Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP, Biomater. Sci., 2022, 10, 1166–1192

[2] Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. J Control Release. 2022;342:345-361.



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