聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級(jí)會(huì)員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機(jī)：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號(hào)3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，mRNA療法作為一種新興的治療手段，因其可編程性強(qiáng)、響應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)備受關(guān)注。在mRNA疫苗和基因治療等領(lǐng)域中，高效合成高質(zhì)量的mRNA是實(shí)現(xiàn)療法目標(biāo)的關(guān)鍵步驟。而在這一過程中，T7 RNA聚合酶扮演著至關(guān)重要的角色，它能夠高效地催化體外合成mRNA的過程。
盡管T7 RNA聚合酶在mRNA合成中發(fā)揮著重要作用，但實(shí)際操作中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生雙鏈RNA（dsRNA）這一副產(chǎn)物。dsRNA的存在不僅降低了mRNA的產(chǎn)量和純度，還可能激發(fā)非特異性免疫反應(yīng)，影響療效和安全性。因此，減少dsRNA的產(chǎn)生成為了行業(yè)的一個(gè)迫切需求。
目前，降低dsRNA的方法主要包括優(yōu)化反應(yīng)條件和使用輔助酶等。這些方法雖然可以在一定程度上減少dsRNA的產(chǎn)生，但往往伴隨著操作復(fù)雜、成本提高等問題。與之相比，通過直接改造T7 RNA聚合酶來降低dsRNA的產(chǎn)生則是一種更為根本的解決方案。酶定向改造技術(shù)可以通過精確改變酶的氨基酸序列或結(jié)構(gòu)，從而改善其催化特性，提高產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。對(duì)于T7 RNA聚合酶而言，針對(duì)性的改造不僅可以減少dsRNA的產(chǎn)生，還能提升合成mRNA的整體效率和質(zhì)量。
作為mRNA體外合成原料供應(yīng)商（了解更多），翌圣生物憑借子公司鎂孚泰生物的ZymeEditor定向進(jìn)化平臺(tái)的能力，持續(xù)在進(jìn)化mRNA體外合成的核心酶原料——T7 RNA聚合酶。為了盡可能消除體外轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生的dsRNA等副產(chǎn)物，鎂孚泰生物進(jìn)化團(tuán)隊(duì)通過理性設(shè)計(jì)與定向篩選結(jié)合的方式對(duì)T7 RNA聚合酶進(jìn)行改造。
圖1. 能壘示意圖及dsRNA形成原理
在進(jìn)行T7 RNA 聚合酶改造過程中，鎂孚泰生物一方面通過結(jié)構(gòu)及自由能分析，發(fā)現(xiàn)在T7 RNA聚合酶構(gòu)象變化的同時(shí)也伴隨著能量的變化，且延伸構(gòu)象的自由能顯著高于起始構(gòu)象，意味著轉(zhuǎn)錄過程需要越過較高的能壘才能產(chǎn)生完整的mRNA鏈。高能壘不利于構(gòu)象平穩(wěn)轉(zhuǎn)變，為此，團(tuán)隊(duì)借助虛擬篩選手段鎖定了20余個(gè)熱點(diǎn)氨基酸，并構(gòu)建了相應(yīng)的定點(diǎn)飽和文庫(kù)。另一方面，考慮到關(guān)于T7 RNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移及RDRP活性相關(guān)的功能、位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域的報(bào)導(dǎo)較少，且由于功能相近這兩種活性極可能與T7 RNA聚合酶主反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄活性（即DNA依賴的RNA聚合活性，DDRP）共享關(guān)鍵位點(diǎn)，難以找到熱點(diǎn)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)改造。因此，鎂孚泰生物同時(shí)構(gòu)建了基于易錯(cuò)PCR的數(shù)個(gè)隨機(jī)突變文庫(kù)，結(jié)合ZymeEditor平臺(tái)的進(jìn)化通量，單個(gè)文庫(kù)的多樣性超過106。
為了兼顧T7 RNA聚合酶的產(chǎn)量并監(jiān)測(cè)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中dsRNA的含量，鎂孚泰生物參照優(yōu)化后的轉(zhuǎn)錄模板，精心設(shè)計(jì)了多個(gè)分子信標(biāo)（FRET RNA探針），分別靶向目標(biāo)mRNA產(chǎn)物的不同區(qū)域，將反應(yīng)物產(chǎn)量、完整度以及體系內(nèi)dsRNA含量等信息與熒光信號(hào)關(guān)聯(lián)，體系的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，突變體的性能越有優(yōu)勢(shì)。理論上，該篩選方法可按不同探針的熒光強(qiáng)度排序，分別獲得高產(chǎn)或Abortive RNA減少的T7 RNA聚合酶突變體，以及完整度提升或loopback dsRNA降低的T7 RNA聚合酶突變體。將反應(yīng)模板更換為RNA時(shí)還可負(fù)向篩選突變體的RDRP活性，提升T7 RNA聚合酶的模板選擇能力。此外，在液滴反應(yīng)體系中添加修飾核苷酸、帽類似物，以及提高反應(yīng)溫度還可以進(jìn)一步篩選耐受非天然底物、熱穩(wěn)定性提升的T7 RNA聚合酶突變體。
圖2. FADS篩選流程【5】
圖3. MTPS篩選流程
圖4. 酶進(jìn)化歷程及突變體性能表征
客戶試用滿意度高
目前我們還有少量試用名額，如您需要試用或者改造酶的其他性能，點(diǎn)擊閱讀原文或在線填寫需求表！
鎂孚泰生物科技（上海）有限公司（鎂孚泰生物，Molefuture）是翌圣生物科技（上海）股份有限公司旗下的全資子公司，是一家以酶進(jìn)化技術(shù)為驅(qū)動(dòng)、專注于提供酶改造定制化解決方案的創(chuàng)新型企業(yè)。依托于翌圣生物，鎂孚泰生物現(xiàn)有六大技術(shù)平臺(tái)：ZymeEditor創(chuàng)新酶進(jìn)化平臺(tái)、多宿主高效表達(dá)平臺(tái)、發(fā)酵工藝開發(fā)平臺(tái)、純化工藝開發(fā)平臺(tái)、超潔凈酶生產(chǎn)平臺(tái)以及酶分析與質(zhì)控平臺(tái)?；谶@六大技術(shù)平臺(tái)，鎂孚泰生物可提供酶定向改造、新酶開發(fā)、酶工藝開發(fā)以及GMP級(jí)別規(guī)模化生產(chǎn)的全套定制解決方案，以滿足酶在體外診斷、生物醫(yī)藥、合成生物、醫(yī)療美容、醫(yī)藥中間體等領(lǐng)域的應(yīng)用需求。
關(guān)注鎂孚泰 微信公眾號(hào)，獲取更多酶改造知識(shí)！
參考文獻(xiàn)：
[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polymerase[J]. Progress in nucleic acid research and molecular biology, 2003: 1-41.
[2] Steitz T A. The structural changes of T7 RNA polymerase from transcription initiation to elongation[J]. Current opinion in structural biology, 2009, 19(6): 683-690.[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel B M, et al. Fluorescence-activated droplet sorting for single-cell directed evolution[J]. ACS synthetic biology, 2019, 8(6): 1430-1440.
[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. 3′ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character—RNA-Seq analyses[J]. Nucleic acids research, 2018, 46(18): 9253-9263.
[5] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, Chaput JC. Fluorescence-Activated Droplet Sorting for Single-Cell Directed Evolution. ACS Synth Biol. 2019 Jun 21;8(6):1430-1440.
