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隨著生物技術的飛速發展，mRNA療法作為一種新興的治療手段，因其可編程性強、響應速度快等優勢備受關注。在mRNA疫苗和基因治療等領域中，高效合成高質量的mRNA是實現療法目標的關鍵步驟。而在這一過程中，T7 RNA聚合酶扮演著至關重要的角色，它能夠高效地催化體外合成mRNA的過程。
盡管T7 RNA聚合酶在mRNA合成中發揮著重要作用，但實際操作中經常會產生雙鏈RNA（dsRNA）這一副產物。dsRNA的存在不僅降低了mRNA的產量和純度，還可能激發非特異性免疫反應，影響療效和安全性。因此，減少dsRNA的產生成為了行業的一個迫切需求。
目前，降低dsRNA的方法主要包括優化反應條件和使用輔助酶等。這些方法雖然可以在一定程度上減少dsRNA的產生，但往往伴隨著操作復雜、成本提高等問題。與之相比，通過直接改造T7 RNA聚合酶來降低dsRNA的產生則是一種更為根本的解決方案。酶定向改造技術可以通過精確改變酶的氨基酸序列或結構，從而改善其催化特性，提高產物的純度和產率。對于T7 RNA聚合酶而言，針對性的改造不僅可以減少dsRNA的產生，還能提升合成mRNA的整體效率和質量。
作為mRNA體外合成原料供應商（了解更多），翌圣生物憑借子公司鎂孚泰生物的ZymeEditor定向進化平臺的能力，持續在進化mRNA體外合成的核心酶原料——T7 RNA聚合酶。為了盡可能消除體外轉錄過程產生的dsRNA等副產物，鎂孚泰生物進化團隊通過理性設計與定向篩選結合的方式對T7 RNA聚合酶進行改造。
圖1. 能壘示意圖及dsRNA形成原理
在進行T7 RNA 聚合酶改造過程中，鎂孚泰生物一方面通過結構及自由能分析，發現在T7 RNA聚合酶構象變化的同時也伴隨著能量的變化，且延伸構象的自由能顯著高于起始構象，意味著轉錄過程需要越過較高的能壘才能產生完整的mRNA鏈。高能壘不利于構象平穩轉變，為此，團隊借助虛擬篩選手段鎖定了20余個熱點氨基酸，并構建了相應的定點飽和文庫。另一方面，考慮到關于T7 RNA聚合酶的末端轉移及RDRP活性相關的功能、位點及結構域的報導較少，且由于功能相近這兩種活性極可能與T7 RNA聚合酶主反應的轉錄活性（即DNA依賴的RNA聚合活性，DDRP）共享關鍵位點，難以找到熱點氨基酸進行定點改造。因此，鎂孚泰生物同時構建了基于易錯PCR的數個隨機突變文庫，結合ZymeEditor平臺的進化通量，單個文庫的多樣性超過106。
為了兼顧T7 RNA聚合酶的產量并監測體外轉錄反應中dsRNA的含量，鎂孚泰生物參照優化后的轉錄模板，精心設計了多個分子信標（FRET RNA探針），分別靶向目標mRNA產物的不同區域，將反應物產量、完整度以及體系內dsRNA含量等信息與熒光信號關聯，體系的熒光強度越強，突變體的性能越有優勢。理論上，該篩選方法可按不同探針的熒光強度排序，分別獲得高產或Abortive RNA減少的T7 RNA聚合酶突變體，以及完整度提升或loopback dsRNA降低的T7 RNA聚合酶突變體。將反應模板更換為RNA時還可負向篩選突變體的RDRP活性，提升T7 RNA聚合酶的模板選擇能力。此外，在液滴反應體系中添加修飾核苷酸、帽類似物，以及提高反應溫度還可以進一步篩選耐受非天然底物、熱穩定性提升的T7 RNA聚合酶突變體。
圖2. FADS篩選流程【5】
圖3. MTPS篩選流程
圖4. 酶進化歷程及突變體性能表征
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鎂孚泰生物科技（上海）有限公司（鎂孚泰生物，Molefuture）是翌圣生物科技（上海）股份有限公司旗下的全資子公司，是一家以酶進化技術為驅動、專注于提供酶改造定制化解決方案的創新型企業。依托于翌圣生物，鎂孚泰生物現有六大技術平臺：ZymeEditor創新酶進化平臺、多宿主高效表達平臺、發酵工藝開發平臺、純化工藝開發平臺、超潔凈酶生產平臺以及酶分析與質控平臺。基于這六大技術平臺，鎂孚泰生物可提供酶定向改造、新酶開發、酶工藝開發以及GMP級別規模化生產的全套定制解決方案，以滿足酶在體外診斷、生物醫藥、合成生物、醫療美容、醫藥中間體等領域的應用需求。
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