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HCP概念和檢測的必要性
生物制品通常是通過重組技術經(jīng)由宿主細胞（如細菌、酵母、哺乳動物、昆蟲或植物細胞）進行生產(chǎn)的，產(chǎn)品類型包括單克隆抗體、重組蛋白和疫苗等。這些產(chǎn)品的制造和純化過程不可避免的會引入宿主細胞蛋白（Host Cell Protein，HCP）雜質，既包括宿主細胞的結構蛋白也包括宿主細胞分泌的促生長因子等，是具有多種生理化學和免疫學特性的復雜混合物。盡管使用先進的純化技術，但一些宿主細胞蛋白仍將作為工藝相關雜質殘留在中間藥物產(chǎn)品中。
這些雜質有潛在的免疫原性，也可能作為佐劑增強生物藥物的產(chǎn)品的免疫反應，還會影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和功效，從而引發(fā)人體安全性風險，因此，對于HCP的去除水平需要建立合適的監(jiān)測策略，并控制終產(chǎn)品中HCP的含量以符合藥物質量的要求。
HCP法規(guī)監(jiān)管要求
生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產(chǎn)品的關鍵質量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價指標，也是產(chǎn)品的重要質控指標。各國法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCP降低到可接受的水平。對HCP的接受程度將根據(jù)具體情況進行評估，并取決于多個因素，其中包括：劑量、給藥頻率、藥物類型和疾病嚴重程度。
《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對CHO細胞，HCP殘留需要<0.05%（相當于小于500ppm）；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。
美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP，其含量應該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應小于100ng，也即<0.01%）。
歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定：在生物制品中，HCP的含量應當小于0.1%。
國際人用藥品注冊技術協(xié)調會（ICH）指南：ICH Q6B指出，需要根據(jù)ICH準則采用敏感且經(jīng)過驗證的有效方法來監(jiān)控殘留的HCP，其殘留量通常要求小于100ppm。
由此可見，監(jiān)管機構對于HCP的要求是高度一致的，生物制品的工藝開發(fā)必須經(jīng)過HCP檢測，并證明純化工藝能夠將HCP降低到安全水平，并且在最終產(chǎn)品的殘留量限值中，中美的推薦限度值均在0.01%以下。
HCP檢測方法
酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。
美國藥典USP<1132>章節(jié)中也提到可采用電泳法、ELISA和LC-MS/MS等方法檢測HCP含量，且由于ELISA法操作簡便、快速、高靈敏、高通量等特點，而被推薦為HCP檢測的方法。
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)
用途：
檢測HCP中蛋白的總量，可用于產(chǎn)品開發(fā)和過程控制，目前是檢測HCPs的常用方法。
優(yōu)勢：
高靈敏度和特異性；
高通量及可實現(xiàn)自動化；
定量性；
操作簡便、快速。
劣勢：
需要特異性抗體；
無法特異鑒別和評估單個HCP；
方法開發(fā)較為復雜，抗原需要特殊制備；
方法的影響因素較多，HCPs覆蓋率需評估；
無法鑒定出種類。
免疫印跡(Western Blotting)
用途：
用于大量樣品的一致性篩選，以及檢測與抗HCPs抗體反應的未知蛋白。適用于檢測HCPs,并提供HCPs相對分子質量的大概信息。
優(yōu)勢：
特異性；
結果直觀可視化：通過蛋白質大小和表達水平的差異進行可視化；
可檢定和定量特定的HCP。
劣勢：
半定量性；
僅限于特定蛋白：只能檢測到與抗體結合的HCP；
對復雜蛋白質混合物不夠敏感；
蛋白質SDS變性可能導致構象表位的丟失；
靈敏度需依賴多克隆抗體質量。
二維凝膠電泳法(2-DE)
用途：
常用于上游或下游工藝開發(fā)和表征，其可在單一凝膠上分辨不同HCPs。
優(yōu)勢：
不需要免疫印跡，避免了轉膜的問題；
可以實現(xiàn)痕量HCPs雜質與產(chǎn)品的分離；
提供大概相對分子質量和等電點信息。
劣勢：
過量的蛋白可能會掩蓋HCPs斑點；
可觀察到樣品中HCP的分布，但無法量化。
質譜分析(Mass Spectrometry)
用途：
鑒定單個HCP，提供準確的宿主細胞蛋白鑒定和定量信息
優(yōu)勢：
高分辨率和準確性；
鑒定及監(jiān)控各個HCP；
提供HCP的全面譜圖；
能夠覆蓋廣泛的蛋白質；
可鑒定出HCP種類。
劣勢：
設備和技術要求高；
操作較為復雜；
成本較高；
方法通量低；
較為復雜的樣品前處理；
潛在的基質影響；
需要專業(yè)的數(shù)據(jù)分析能力。
ELISA是各國藥典推薦的在生物制品中檢測殘留HCP的方法，可以測定HCP的總量，但其存在局限性，無法鑒別HCP的種類及豐度，需要其他方法與之互相補充。每種檢測方法都各有其優(yōu)缺點，在實際應用中，可以根據(jù)實驗目的、樣品特性、準確性和操作便捷性等方面進行選擇，結合使用不同的方法來獲得更全面和準確的結果。
此外，美國藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS指出在產(chǎn)品開發(fā)的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCP的檢測，并將HCP檢測方法分為：商業(yè)化試劑盒、產(chǎn)品/工藝專屬性方法和平臺化方法。
USP<1132>提到在沒有平臺化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒；在臨床III期/工藝驗證及產(chǎn)品上市后，由于商業(yè)化的通用HCP檢測試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性，需要考慮結合細胞類型及工藝特異性等因素，使用平臺化方法或針對上游工藝開發(fā)的產(chǎn)品/工藝專屬性方法。
圖1.USP <1132>中產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測方法的建議
方法 | 通用商品化試劑盒 | 項目專屬性檢測方法 | 平臺化檢測方法 |
可用性 | 即時可用 | 需要制備抗原，包括克隆空載體細胞系 | 需要使用裸細胞系或空載體細胞系制備抗原 |
開發(fā) | 無需太多準備工作 | 包括抗原表征、免疫和確認在內(nèi)的檢測開發(fā)至少需要6個月時間 | 包括抗原表征、免疫和確認在內(nèi)的檢測開發(fā)至少需9個月時間 |
多樣性 | 僅限于最常見的表達系統(tǒng) | 各類型表達系統(tǒng)均可用 | 各類型表達系統(tǒng)均可用 |
特異性 | 特異性可能不佳，很可能有未檢測到的HCP | 特異性通常有所增強，抗體覆蓋率更能針對特定的HCP模式 | 與商業(yè)檢測方法相比，特異性有所提高，對檢測性能的理解有所增強，對HCP種類的覆蓋率也有所提高 |
費用 | 初期價格相對便宜，但對整個下游純化過程而言，開發(fā)成本將迅速上升 | 初期成本較高，但收支平衡點通常是在100套試劑盒的價值 | 由于可用于多種產(chǎn)品，具有顯著的成本優(yōu)勢 |
依賴性 | 依賴于某個供應商，試劑和控制方案屬于“黑箱"狀態(tài)。 | 能對所有試劑和緩沖液取得全面控制，可以隨時進行調整 | 對所有試劑具有完整的所有權和控制權，可降低供應鏈和批次可比性的風險 |
監(jiān)管需求 | 不適合用于支持上市許可申請 | 適用于支持許可產(chǎn)品從早期開發(fā)到最終產(chǎn)品上市的整個過程 | 適用于支持早期開發(fā)直至上市許可的整個過程 |
表2.不同HCP試劑盒類型的比較
翌圣生物通用商品化HCP試劑盒
ELISA法是一種使用簡單、靈敏度高且客觀的HCP檢測方法。翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了多款能夠檢測使用了宿主細胞進行轉染以及蛋白表達的各生物制品下游純化過程樣品以及終產(chǎn)品中宿主蛋白殘留量的試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質控制以及終產(chǎn)品的放行檢測。
宿主細胞殘留蛋白檢測 | 貨號與 |
E.coli HCP ELISA檢測試劑盒 | 36712ES |
E.coli HCP ELISA 檢測試劑盒（質粒） | 36721ES |
HEK293 HCP ELISA檢測試劑盒 | 36713ES |
CHO HCP ELISA檢測試劑盒 | 36714ES |
翌圣生物定制化HCP試劑盒開發(fā)服務
鑒于HCP檢測的重要性，翌圣生物以高性能單克隆抗體研發(fā)平臺為依托，建立了蛋白抗體關鍵原料研發(fā)平臺和獨立的免疫檢測產(chǎn)品開發(fā)實驗室，并配備了先進研發(fā)儀器設備，如：酶標儀和2D-WB雙向凝膠電泳-免疫印跡儀等。研發(fā)平臺已經(jīng)非常成熟，可以快速完成哺乳動物細胞、昆蟲細胞（如Sf9）、細菌和酵母等多種宿主細胞殘留蛋白（HCP）試劑盒定制服務。
宿主細胞殘留蛋白檢測試劑盒定制服務，周期6~10個月。
抗原抗體制備：確定HCP抗原、建立HCP參考品、制定免疫路徑和策略、制備HCP抗體等，周期通常4~6個月；
試劑盒開發(fā)：抗體優(yōu)化、覆蓋率分析、試劑盒方法驗證等，周期通常2~4個月。
翌圣生物HCP抗體覆蓋率驗證服務
已知，ELISA法是行業(yè)內(nèi)檢測HCP殘留的金標準，然而該方法的準確性取決于多克隆抗體對HCP的覆蓋率。《美國藥典》和《歐洲藥典》中提到免疫親和純化、2D-WB是表征HCP ELISA抗體及其覆蓋率的推薦方法。
2D-WB首先采用二維凝膠根據(jù)大小和電荷分離蛋白質，然后將這些蛋白質轉移到膜上與 HCP 抗體一起孵育以進行蛋白質印跡檢測。
翌圣生物擁有全套2D-WB儀器設備和豐富的實驗室操作經(jīng)驗，可針對CHO、E.coli、HEK293等宿主細胞的HCP樣品，提供抗體覆蓋率驗證服務。
參考文獻：
[1]USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.
[2]USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.
[3]EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.
[4]2020版《中國藥典》3412大腸埃希菌菌體蛋白質殘留量測定法、3413假單胞菌菌體蛋白質殘留量測定法、3414酵母工程菌菌體蛋白質殘留量測定法。
