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漲知識 | 克隆專題八:一步法快速克隆FAQ——常見問題解答

2023-12-25  閱讀(473)

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克隆技術,又稱為“生物放大技術",目前應用泛的技術為“分子克隆",即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來,在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達,產生新的遺傳性狀的技術。

 

大部分的分子克隆方法,諸如傳統分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉化、篩選等等步驟。因為步驟較多且知識點復雜,在實驗的過程中就會遇到各種各種的問題,尤其是各位科研兒們運用最多的同源重組技術。接下來小翌會具體解答一下同源重組中常見的問題,為您的實驗提供好方法。


 

Q1
 

一步法快速克隆試劑盒運用到的分子克隆技術是什么?

翌圣Hieff Clone®系列一步法快速克隆試劑盒運用的是Gibson Assembly同源重組技術,其使用的同源重組酶兼具外切酶活性、DNA聚合酶活性和連接酶活性。

 

  1. 外切酶活性:該酶能特異性地識別載體和插入片段末端的15-25 bp的同源序列,并沿著5';→3';方向切割dsDNA,從而產生粘性末端,粘性末端的堿基在50℃作用下進行互補配對,將具備同源序列的載體與插入片段“融合"。
  2. DNA聚合酶活性:外切酶作用后,并不能保證將片段和載體的5’末端都降解成一樣長的粘性末端,同源末端退火配對后,還存在單鏈的堿基缺口。故需要借助DNA聚合酶活性進行修復。
  3. 連接酶活性:催化形成磷酸二酯鍵,將所有缺口縫合。
     

 

圖1.同源重組原理

 

Q2
 

與傳統分子克隆相比,一步法快速克隆試劑盒有什么優勢?

應用廣泛:可用于單片段或多片段定向克隆,也可結合Canace高保真酶,應用于定點突變;


設計簡單:在插入片段的PCR擴增引物5’端引入15-25 bp與載體末端同源的序列即可。

 

 

小翌在這里給大家推薦一款翌圣新品,通用型多片段一步法快速克隆試劑盒(Cat#10923ES),該產品連接效率高,菌落數多,小體系連接不僅省酶,也省片段/載體!

 

Q3
 

一步法克隆試劑盒連接反應總體系20 μL,但載體/片段濃度低可否使用小體系連接?

可以。翌圣通用型多片段一步法快速克隆試劑盒10923ES,經過大量的內部測試和市場驗證,連接反應總體系可以低至6 μL,小體系連接效率高,上市至今客戶反饋使用效果好!

 

 
小體系高效率重組
 
 
實驗信息:載體大小:5369 bp;目的片段大小:1589 bp。
實驗數據:

 

圖2. 10923ES在10 μL小反應體系下,低濃度載體(30 ng)連接單片段,陽性率100%。A:重組轉化平板。B:插入片段PCR鑒定電泳圖,泳道1-5分別為菌落1,菌落2,陰性對照,陽性對照(基因組作為模版),陽性對照(PCR純化片段作為模版)。(上海交通大學)

 

 
小體系高效率重組
 
 
實驗信息:載體大小:1600 bp;目的片段大小:1000 bp。
實驗數據:

 

 

圖3. 10923ES在10 μL小反應體系下,陽性率高。A:重組轉化平板。B:插入片段PCR鑒定電泳圖。(武漢大學)

 

 
小體系長載體高效率重組
 
 
實驗信息:載體大小:10000 bp;目的片段大小:1011 bp。
實驗數據:

 

圖4. 10923ES在10 μL小反應體系下,低濃度長載體(50 ng)連接單片段,陽性率高。A:重組轉化平板。B:插入片段PCR鑒定電泳圖。(河南農業大學)
 
 

超短片段高效率重組

 
 
實驗信息:載體大小:5000 bp;目的片段大小:72 bp。
實驗數據:

 

圖5. 10923ES連接72 bp超短片段(20 ng),菌落數多于競品,陽性率高。A:重組轉化平板。B:插入片段測序鑒定圖。(浙江大學)

 

 

多片段高效率重組

 
 
實驗信息:載體大小:5400 bp;目的片段大小:1500 bp,66 bp。
實驗數據:

 

圖6. 10923ES在低濃度載體(45 ng)下連接二片段,菌落數多,陽性率高。A:重組轉化平板。B:插入片段測序鑒定圖。(中國科學技術大學)

 

 

Q4
 

一步法克隆連接后無陽性克隆或者菌落數少,是什么原因造成的,該怎么解決呢?

詳細閱讀下表,為您提供解決方案~

 

出現問題

原因分析

解決方法

無克隆長出或克隆數較少?

原因1:引物設計錯誤

①設計原則:同源臂(15-25bp,GC含量40-60%)+酶切位點(根據實驗需求保留或刪除)+基因特異性引物(常規插入片段擴增引物)。

②判斷方法:使用翌圣無縫克隆引物設計軟件核對

原因2:線性化載體與目的片段使用量錯誤

線性化載體與目的片段添加比例:最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3,最適載體使用量為0.03 pmol;最適目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。

注:a、片段長度大于載體時,最適載體與目的片段使用量的計算方式應互換,即目的片段當做載體,載體當做目的片段進行計算。

b、線性化載體的使用量應在50-200ng之間;目的片段擴增產物的使用量應在20-200ng之間。當使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時,則選擇或最高使用量即可。

原因3:載體與目的片段不純

推薦對線性化載體、PCR產物進行膠回收純化。重組反應體系中應盡量避免金屬絡合劑(如EDTA)的帶入,故DNA純化產物不能使用TE進行DNA保存,可溶解在pH8.0的ddH2O中保存。未純化DNA加入重組反應體系內的總體積不應超過反應體系體積1/5。

原因4:操作問題或試劑盒失效

推薦做試劑盒自帶的陽性對照實驗,若陽性對照有克隆并檢測為陽性,則排除試劑盒問題。若陽性對照無克隆,可能是操作問題或試劑盒失效,建議換其他人進行陽性對照實驗,進一步排除是否為操作問題。

原因5:感受態細胞效率低,<107cfu/μg

轉化效率檢測方法:轉化0.1ng質粒(如PUC19),生長1000個菌斑,估算轉化效率為107cfu/μg。

假陽性—不含插入片段(空載)?

原因1:載體線性化 

判斷方法:將已制備的線性化的載體轉化涂板,如果長克隆較多,則表示線性化 。

解決方案:若線性化 則需優化酶切體系,例如提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物等。

原因2:反應體系中混入了相同抗性的環狀質粒

判斷方法:將已制備的線性化載體和目的片段分別轉化涂板,如果長克隆較多,則表示有相同抗性的環狀質粒混入。

解決方案:PCR擴增產物先用DpnI消化模板后,再進行膠回收純化處理或直接進行膠回收純化處理,去除殘留的環狀模板質粒導致的假陽性。

假陽性—含不正確的插入片段?

原因1:PCR產物混有非特異擴增產物

可能情況:PCR擴增目的基因時有非特異條帶出現,未進行膠回收純化。

解決方案:

①優化PCR體系,提高特異性;

②膠回收PCR產物;

③鑒定更多的克隆。

原因2:片段缺失

可能情況:載體或片段有多個同源重復序列。

解決方案:借助網站或軟件進行序列比對(如NCBI,VectorNTI等)。

菌落PCR無目的條帶?

原因1:菌落PCR引物錯誤

推薦使用載體的通用引物進行菌檢,或至少使用一條通用引物。

原因2:PCR試劑Mix不穩定,PCR體系或程序不合適

①更換新的PCR試劑盒

②優化PCR體系、程序;

③提取質粒,以質粒做模板PCR驗證;

④換成質粒酶切鑒定陽性克隆。

原因3:載體線性化 

可能情況:目的片段引物+一端載體通用引物,或另一端目的片段引物擴增無產物,而載體通用引物擴增有產物,且大小符合空載。

解決方案:優化酶切體系。例如提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物等。

測序后插入片段有缺失或者突變?

原因1:PCR擴增試劑的高保真性不強,導致位點缺失或突變

快速克隆試劑盒作用于15-25 bp的同源臂上,不會導致片段中間的位點缺失或者突變。

解決方案:更換保真性更高的PCR擴增試劑盒

原因2:在切膠回收過程中,紫外下切膠過久導致突變

減少切膠時間,避免膠長時間暴露于紫外光下

 

 
 
 
 
 
 

 

以上,就是一步法快速克隆試劑盒的FAQ,請您查收~再加上您的細心、耐心與恒心,做實驗必定事半功倍,一氣呵成!

 

 

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