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克隆技術，又稱為“生物放大技術"，目前應用泛的技術為“分子克隆"，即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生新的遺傳性狀的技術。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉化、篩選等等步驟。因為步驟較多且知識點復雜，在實驗的過程中就會遇到各種各種的問題，尤其是各位科研兒們運用最多的同源重組技術。接下來小翌會具體解答一下同源重組中常見的問題，為您的實驗提供好方法。
一步法快速克隆試劑盒運用到的分子克隆技術是什么？
外切酶活性：該酶能特異性地識別載體和插入片段末端的15-25 bp的同源序列，并沿著5';→3';方向切割dsDNA，從而產生粘性末端，粘性末端的堿基在50℃作用下進行互補配對，將具備同源序列的載體與插入片段“融合"。 DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保證將片段和載體的5’末端都降解成一樣長的粘性末端，同源末端退火配對后，還存在單鏈的堿基缺口。故需要借助DNA聚合酶活性進行修復。 連接酶活性：催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口縫合。
圖1.同源重組原理
與傳統分子克隆相比，一步法快速克隆試劑盒有什么優勢？
應用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結合Canace高保真酶，應用于定點突變；
設計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5’端引入15-25 bp與載體末端同源的序列即可。
一步法克隆試劑盒連接反應總體系20 μL，但載體/片段濃度低可否使用小體系連接？
超短片段高效率重組
多片段高效率重組
一步法克隆連接后無陽性克隆或者菌落數少，是什么原因造成的，該怎么解決呢？
出現問題 | 原因分析 | 解決方法 |
無克隆長出或克隆數較少？ | 原因1：引物設計錯誤 | ①設計原則：同源臂（15-25bp，GC含量40-60%）+酶切位點(根據實驗需求保留或刪除)+基因特異性引物（常規插入片段擴增引物）。 ②判斷方法：使用翌圣無縫克隆引物設計軟件核對 |
原因2：線性化載體與目的片段使用量錯誤 | 線性化載體與目的片段添加比例：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，最適載體使用量為0.03 pmol；最適目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。 注：a、片段長度大于載體時，最適載體與目的片段使用量的計算方式應互換，即目的片段當做載體，載體當做目的片段進行計算。 b、線性化載體的使用量應在50-200ng之間；目的片段擴增產物的使用量應在20-200ng之間。當使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時，則選擇或最高使用量即可。 | |
原因3：載體與目的片段不純 | 推薦對線性化載體、PCR產物進行膠回收純化。重組反應體系中應盡量避免金屬絡合劑（如EDTA）的帶入，故DNA純化產物不能使用TE進行DNA保存，可溶解在pH8.0的ddH2O中保存。未純化DNA加入重組反應體系內的總體積不應超過反應體系體積1/5。 | |
原因4：操作問題或試劑盒失效 | 推薦做試劑盒自帶的陽性對照實驗，若陽性對照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。若陽性對照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人進行陽性對照實驗，進一步排除是否為操作問題。 | |
原因5：感受態細胞效率低，＜107cfu/μg | 轉化效率檢測方法：轉化0.1ng質粒（如PUC19），生長1000個菌斑，估算轉化效率為107cfu/μg。 | |
假陽性—不含插入片段（空載）？ | 原因1：載體線性化 | 判斷方法：將已制備的線性化的載體轉化涂板，如果長克隆較多，則表示線性化 。 解決方案：若線性化 則需優化酶切體系，例如提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物等。 |
原因2：反應體系中混入了相同抗性的環狀質粒 | 判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環狀質粒混入。 解決方案：PCR擴增產物先用DpnI消化模板后，再進行膠回收純化處理或直接進行膠回收純化處理，去除殘留的環狀模板質粒導致的假陽性。 | |
假陽性—含不正確的插入片段？ | 原因1：PCR產物混有非特異擴增產物 | 可能情況：PCR擴增目的基因時有非特異條帶出現，未進行膠回收純化。 解決方案： ①優化PCR體系，提高特異性； ②膠回收PCR產物； ③鑒定更多的克隆。 |
原因2：片段缺失 | 可能情況：載體或片段有多個同源重復序列。 解決方案：借助網站或軟件進行序列比對（如NCBI，VectorNTI等）。 | |
菌落PCR無目的條帶？ | 原因1：菌落PCR引物錯誤 | 推薦使用載體的通用引物進行菌檢，或至少使用一條通用引物。 |
原因2：PCR試劑Mix不穩定，PCR體系或程序不合適 | ①更換新的PCR試劑盒 ②優化PCR體系、程序； ③提取質粒，以質粒做模板PCR驗證； ④換成質粒酶切鑒定陽性克隆。 | |
原因3：載體線性化 | 可能情況：目的片段引物+一端載體通用引物，或另一端目的片段引物擴增無產物，而載體通用引物擴增有產物，且大小符合空載。 解決方案：優化酶切體系。例如提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物等。 | |
測序后插入片段有缺失或者突變？ | 原因1：PCR擴增試劑的高保真性不強，導致位點缺失或突變 | 快速克隆試劑盒作用于15-25 bp的同源臂上，不會導致片段中間的位點缺失或者突變。 解決方案：更換保真性更高的PCR擴增試劑盒 |
原因2：在切膠回收過程中，紫外下切膠過久導致突變 | 減少切膠時間，避免膠長時間暴露于紫外光下。 |
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