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漲知識 | 克隆專題一:不同分子克隆方法介紹(上)

2023-10-13  閱讀(1174)

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漲知識 | 克隆專題一:不同分子克隆方法介紹(上)

 


克隆是英文“clone"或“cloning"的音譯,而英文“clone"則起源于希臘文“Klone",原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性"的演講上采用“克隆(Clone)"的術語,把“克隆技術"帶到了人們的視野中。

 

克隆技術又稱為“生物放大技術",目前應用泛的技術為“分子克隆",又稱重組DNA技術,即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來,在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達,產生新的遺傳性狀的技術。

 

隨著分子生物學研究的不斷深入,分子克隆技術也隨之更新迭代,從傳統的依賴限制性內切酶的方法發展到如今的TA克隆、TOPO克隆、無縫克隆、Gateway技術等等,新的技術不斷涌現,為分子生物學的發展和進化提供新的力量。今天小翌就帶領大家認識一下不同的分子克隆方法。

 

01
傳統分子克隆技術

傳統分子克隆技術的依賴于限制性內切酶和酶切位點。主要步驟是通過限制性內切酶(翌圣的FuniCut™快速限制性內切酶Cat#15001ES-15051ES)酶切載體和目的基因,通過連接酶(翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300)將酶切的片段拼接在一起(即連接過程),形成可以表達目的基因的新載體(即重組質粒),使用轉化技術轉化至感受態細胞中,進而實現目的基因的擴增、轉錄和翻譯。

 

傳統分子克隆實驗流程如下圖:

圖1.傳統分子克隆實驗流程

 

該技術最早由Cohen Group在1973年實現,他們將E.coli的tetr質粒psclol和nersrR6-3質粒體外限制酶切割,連接成新的質粒,轉化E.coli,在含四環素和新霉素的平板上篩選出了terrNer,實現了細菌遺傳性狀的轉移。傳統分子克隆技術較為成熟,但是該方法受到限制性酶切位點和連接效率等方面的限制,并不能高效、準確的克隆需要的目的基因。

 

圖2. Stanley Cohen和Herbert Boyer(第一個成功實現基因工程技術的團隊)

 

02
TA克隆
TA克?。∣riginal TA Cloning Kit),依賴于PCR反應中所使用的聚合酶具有末端轉移的活性,通常在克隆片段的3’末端加上A尾(即3’-A),通過連接酶(翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300)把克隆片段與一個具有3’-T突出的載體DNA連接起來。主要應用于不清楚目的基因DNA序列的實驗,通過TA克隆重組到T-載體后,使用T-載體的上下游引物擴增片段,測序,最終確定目的基因序列。其中,聚合酶的選擇尤為重要,翌圣普通PCR試劑盒(Cat#10102/10103/10157)、翌圣快速PCR試劑盒(Cat#10157)均具有Taq DNA聚合酶,擴增后的PCR產物具有3’-dA突出端,可輕松克隆至T載體。

 

圖3. TA克隆流程示意圖【3】

 

03
TOPO克隆
TOPO克隆技術是通過TOPO載體上偶聯的異構酶(Topoisomerase)實現插入片段的快速克隆。其原理是利用Topo載體兩端通過磷酸鍵偶聯的Topo酶,在連接反應中,受插入片段的5'端羥基的攻擊,磷酸鍵釋放能量。利用該能量,插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起,Topo異構酶從載體分子上脫落,完成連接反應。不同于傳統的TA克隆,TOPO克隆能夠在2-5 min內快速完成插入片段和載體的連接反應,操作簡單,連接效率。

 

圖4. TOPO克隆原理

 

目前市面上的產品,需根據DNA片段末端的不同,選擇不同的TOPO克隆試劑盒。而翌圣新品零背景通用型TOPO克隆試劑盒(Cat#10906),能夠兼容平末端產物或粘性末端產物,不受片段末端影響,快速克隆連接,效率高,陽性率接近100%,如圖5所示。

圖5. TOPO TA/Blunt克隆試劑盒輕松連接2 kb(10 ng)平末端/粘性末端片段
注:A&B:TOPO克隆轉化平板。C&D:插入片段PCR鑒定電泳圖。

 

04
無縫克隆技術
傳統克隆和TA克隆兩種方法費時費力,過程繁冗,為了解決限制性酶切位點的限制,科學家們研發出新的、快速、簡潔、高效的克隆技術——無縫克隆,區別于傳統分子克隆,的差異在于載體末端和引物末端應具有15-20個同源堿基,由此得到的PCR產物兩端便分別帶上15-20個與載體序列同源性的堿基,依靠堿基間作用力互補配對成環,不經過酶切,PCR產物和線性化載體在同源重組酶的作用下,經過一定的時間和溫度即可進行轉化,完成定向克隆。

 

圖6.同源重組原理

 

無縫克隆技術最早是2009年由Daniel Gibson和J. Craig Venter發展起來,廣泛應用的方法包括兩種Gibson Assembly和In-Fusion Cloning,原理都是通過外切酶產生黏性末端,再通過同源重組酶的連接得到重組片段,但是兩種方法的外切酶不同,形成重組序列的方式也不一樣。

Gibson Assembly:包含T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三種酶,通過5’→3’ T5核酸外切酶活性,沿著5’→3’方向降解dsDNA,產生3’黏性末端,通過同源臂互補配對,退火后借助Phusion DNA聚合酶修復片段上的缺口,Taq DNA連接酶催化片段形成磷酸二酯鍵,將所有缺口補齊,獲得重組片段。

 

圖7. Gibson Assembly原理圖【5】

 

In-Fusion Cloning:具有3’→5’ 核酸外切酶,能夠識別3’末端堿基,沿著3’→5’ 方向降解dsDNA,產生5’黏性末端,同源臂互補,退火后配對,因為其不含連接酶,所以要將重組片段轉化到感受態細胞內,序列中的缺口會在感受態體內補平、連接,獲得重組片段。

 

圖8. In-Fusion Cloning原理【6】

 
翌圣同源重組試劑盒利用無縫克隆技術,僅需50℃反應20 min即可轉化,完成定向克隆,克隆陽性率可達95%以上。其中,翌圣一步法快速克隆試劑盒(Cat#10911ES)可連接單片段,該試劑盒已發文章累計IF達到1000+。翌圣通用型一步法快速克隆試劑盒(Cat#10922ES)可連接1-6片段,最長連接片段可達23 kb,是多片段連接的。
 
通過上述的介紹,相信大家已經初步了解了目前實驗室中常用的分子克隆技術,那么還有哪些新開發的分子克隆技術呢?無縫克隆中不常見、特殊的分子克隆技術又有哪些呢?關注我們,小翌會在下一期的分子克隆技術專題中,給大家介紹新的分子克隆技術,為您的實驗帶來新的思路與方向,期待下一次的見面~

 

05
相關產品列表

 

產品定位

產品名稱

產品貨號

規格

通用緩沖液,5min完成精準酶切

FuniCut™快速限制性內切酶

 15001ES-15051ES

50 T

常規PCR

2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye)

10102ES03/08

1 mL/5×1 mL

常規PCR,不含染料

2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye)

10103ES03/08

1 mL/5×1 mL

快速PCR,快至1s/kb

2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye)

10157ES03/08

1 mL/5×1 mL

TOPO克隆-兼容TA/平末端

Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit

10906ES20

20 T

TOPO克隆-TA末端

Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒

10907ES20

20 T

TOPO克隆-平末端

Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit

10909ES20

20 T

單片段一步克隆,已發文章累計IF達到1000+

Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒

10911ES20/50

20 T/50 T

1-6片段一步克隆,最快5分鐘完成重組反應

Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒

10922ES20/50

20 T/50 T

 

參考文獻

1.Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(1), 189-193.
2.Holton TA, Graham MW. A Simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors[J]. Nucleic Acids Res, 1991, 19(5), 1156.
3.Clark D P, Pazdernik N J, Mcgehee M R. Cloning Genes for Synthetic Biology - ScienceDirect[J]. Molecular Biology (Third Edition), 2019:199-239.
4.Seki T, Seki M, Onodera R, et al. Cloning of cDNA encoding a novel mouse DNA topoisomerase III (Topo IIIbeta) possessing negatively supercoiled DNA relaxing activity, whose message is highly expressed in the testis[J]. J Biol Chem, 1998, 273 (44): 28553-28556.
5.Gibson DG, Young L, Chuang RY, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nat Methods, 2009, 6( 5) : 343-345.
6.張陽璞,楊淑慎.幾種新型植物基因表達載體的構建方法[J].生物工程學報,2015,31(03):311-327.



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