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漲知識 | 克隆專題一:不同分子克隆方法介紹(上)
克隆是英文“clone"或“cloning"的音譯,而英文“clone"則起源于希臘文“Klone",原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性"的演講上采用“克隆(Clone)"的術語,把“克隆技術"帶到了人們的視野中。
克隆技術又稱為“生物放大技術",目前應用泛的技術為“分子克隆",又稱重組DNA技術,即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來,在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達,產生新的遺傳性狀的技術。
隨著分子生物學研究的不斷深入,分子克隆技術也隨之更新迭代,從傳統的依賴限制性內切酶的方法發展到如今的TA克隆、TOPO克隆、無縫克隆、Gateway技術等等,新的技術不斷涌現,為分子生物學的發展和進化提供新的力量。今天小翌就帶領大家認識一下不同的分子克隆方法。
傳統分子克隆技術的依賴于限制性內切酶和酶切位點。主要步驟是通過限制性內切酶(翌圣的FuniCut™快速限制性內切酶Cat#15001ES-15051ES)酶切載體和目的基因,通過連接酶(翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300)將酶切的片段拼接在一起(即連接過程),形成可以表達目的基因的新載體(即重組質粒),使用轉化技術轉化至感受態細胞中,進而實現目的基因的擴增、轉錄和翻譯。
傳統分子克隆實驗流程如下圖:
圖1.傳統分子克隆實驗流程
該技術最早由Cohen Group在1973年實現,他們將E.coli的tetr質粒psclol和nersrR6-3質粒體外限制酶切割,連接成新的質粒,轉化E.coli,在含四環素和新霉素的平板上篩選出了terrNer,實現了細菌遺傳性狀的轉移。傳統分子克隆技術較為成熟,但是該方法受到限制性酶切位點和連接效率等方面的限制,并不能高效、準確的克隆需要的目的基因。
圖2. Stanley Cohen和Herbert Boyer(第一個成功實現基因工程技術的團隊)
圖3. TA克隆流程示意圖【3】
圖4. TOPO克隆原理
圖5. TOPO TA/Blunt克隆試劑盒輕松連接2 kb(10 ng)平末端/粘性末端片段
注:A&B:TOPO克隆轉化平板。C&D:插入片段PCR鑒定電泳圖。
圖6.同源重組原理
Gibson Assembly:包含T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三種酶,通過5’→3’ T5核酸外切酶活性,沿著5’→3’方向降解dsDNA,產生3’黏性末端,通過同源臂互補配對,退火后借助Phusion DNA聚合酶修復片段上的缺口,Taq DNA連接酶催化片段形成磷酸二酯鍵,將所有缺口補齊,獲得重組片段。
圖7. Gibson Assembly原理圖【5】
圖8. In-Fusion Cloning原理【6】
產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 | 規格 |
通用緩沖液,5min完成精準酶切 | FuniCut™快速限制性內切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
常規PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規PCR,不含染料 | 2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) | 10103ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
快速PCR,快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
TOPO克隆-TA末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20 T |
TOPO克隆-平末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit | 10909ES20 | 20 T |
單片段一步克隆,已發文章累計IF達到1000+ | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES20/50 | 20 T/50 T |
1-6片段一步克隆,最快5分鐘完成重組反應 | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒 | 10922ES20/50 | 20 T/50 T |
參考文獻
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