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漲知識 | 克隆專題一：不同分子克隆方法介紹（上）
克隆是英文“clone"或“cloning"的音譯，而英文“clone"則起源于希臘文“Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性"的演講上采用“克隆（Clone）"的術(shù)語，把“克隆技術(shù)"帶到了人們的視野中。
克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應用泛的技術(shù)為“分子克隆"，又稱重組DNA技術(shù)，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
隨著分子生物學研究的不斷深入，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代，從傳統(tǒng)的依賴限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的TA克隆、TOPO克隆、無縫克隆、Gateway技術(shù)等等，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為分子生物學的發(fā)展和進化提供新的力量。今天小翌就帶領(lǐng)大家認識一下不同的分子克隆方法。
傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的依賴于限制性內(nèi)切酶和酶切位點。主要步驟是通過限制性內(nèi)切酶（翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶Cat#15001ES-15051ES）酶切載體和目的基因，通過連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）將酶切的片段拼接在一起（即連接過程），形成可以表達目的基因的新載體（即重組質(zhì)粒），使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，進而實現(xiàn)目的基因的擴增、轉(zhuǎn)錄和翻譯。
傳統(tǒng)分子克隆實驗流程如下圖：
圖1.傳統(tǒng)分子克隆實驗流程
該技術(shù)最早由Cohen Group在1973年實現(xiàn)，他們將E.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒體外限制酶切割，連接成新的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer，實現(xiàn)了細菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)較為成熟，但是該方法受到限制性酶切位點和連接效率等方面的限制，并不能高效、準確的克隆需要的目的基因。
圖2. Stanley Cohen和Herbert Boyer（第一個成功實現(xiàn)基因工程技術(shù)的團隊）
圖3. TA克隆流程示意圖【3】
圖4. TOPO克隆原理
圖5. TOPO TA/Blunt克隆試劑盒輕松連接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段
注：A&B：TOPO克隆轉(zhuǎn)化平板。C&D：插入片段PCR鑒定電泳圖。
圖6.同源重組原理
Gibson Assembly：包含T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三種酶，通過5’→3’ T5核酸外切酶活性，沿著5’→3’方向降解dsDNA，產(chǎn)生3’黏性末端，通過同源臂互補配對，退火后借助Phusion DNA聚合酶修復片段上的缺口，Taq DNA連接酶催化片段形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊，獲得重組片段。
圖7. Gibson Assembly原理圖【5】
圖8. In-Fusion Cloning原理【6】
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 規(guī)格 |
通用緩沖液，5min完成精準酶切 | FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
常規(guī)PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規(guī)PCR，不含染料 | 2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) | 10103ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
TOPO克隆-TA末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20 T |
TOPO克隆-平末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit | 10909ES20 | 20 T |
單片段一步克隆，已發(fā)文章累計IF達到1000+ | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES20/50 | 20 T/50 T |
1-6片段一步克隆，最快5分鐘完成重組反應 | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒 | 10922ES20/50 | 20 T/50 T |
參考文獻
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4.Seki T, Seki M, Onodera Ｒ, et al. Cloning of cDNA encoding a novel mouse DNA topoisomerase III (Topo IIIbeta) possessing negatively supercoiled DNA relaxing activity, whose message is highly expressed in the testis[J]. J Biol Chem, 1998, 273 (44): 28553-28556.
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