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漲知識(shí)|qPCR專場(chǎng)四：?jiǎn)栴}圖表分析及實(shí)驗(yàn)案例

2023-8-25　　閱讀(241)

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漲知識(shí)|qPCR專場(chǎng)四：?jiǎn)栴}圖表分析及實(shí)驗(yàn)案例

 


熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測(cè)方法。該方法通過(guò)在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來(lái)記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過(guò)數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來(lái)源。
 
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章呢？

 

在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，難免會(huì)遇到一些奇怪的擴(kuò)增曲線或熔解曲線，不管是開(kāi)辟新課題新項(xiàng)目中的預(yù)實(shí)驗(yàn)探索還是持續(xù)驗(yàn)證中的反復(fù)測(cè)試，都有可能遇見(jiàn)。雖說(shuō)異常曲線可能會(huì)千奇百怪，但仔細(xì)分析，了解清楚具體原因就有助于我們順利完成實(shí)驗(yàn)，不用再投入更多時(shí)間精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

 

 

擴(kuò)增曲線異常
 
無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)
 
 

 

原因分析及解決方案：
熒光定量?jī)x器參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，上機(jī)前對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)采集開(kāi)關(guān)沒(méi)有打開(kāi)。可在問(wèn)題數(shù)據(jù)的運(yùn)行程序中檢查，相關(guān)采集開(kāi)關(guān)是否正常開(kāi)啟。若未正常開(kāi)啟，則需要重新準(zhǔn)備上機(jī)反應(yīng)體系，設(shè)置好對(duì)應(yīng)的參數(shù)，打開(kāi)采集開(kāi)關(guān)再次檢測(cè)。

 

 

儀器界面展示處以7500為例

 

 
有光信號(hào)但無(wú)Ct值
 
 

 

原因分析及解決方案：
擴(kuò)增曲線線性圖顯示為一條筆直的線或?qū)?shù)圖的▲Rn不超過(guò)1且在低水平徘徊，則無(wú)擴(kuò)增。
 
1）可能是引物降解帶來(lái)的影響。當(dāng)引物儲(chǔ)存不當(dāng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致引物降解并失去特異性，進(jìn)而降低擴(kuò)增效率。可通過(guò)核酸電泳的方式檢測(cè)引物的完整性，若原先的特異性條帶變成彌散帶，則表示引物發(fā)生降解。針對(duì)引物保存，需考慮以下四個(gè)建議：

  •  引物凍干粉在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存和儲(chǔ)存溫度上有著更強(qiáng)的靈活性和保障；

  • 引物濃度對(duì)穩(wěn)定性也會(huì)產(chǎn)生影響，不建議以低于10μM的濃度儲(chǔ)存引物，在大多數(shù)情況下，100μM的引物使用更加靈活容易；

  • 引物或探針也需和RNA一樣分裝儲(chǔ)存，以盡可能減少反復(fù)凍融帶來(lái)的影響；

  • TE緩沖液的儲(chǔ)存環(huán)境比水更加穩(wěn)定。

2）可能是模板濃度太低造成檢測(cè)困難。建議減少cDNA稀釋濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)即可，通常情況下，未知濃度的樣品先從原液開(kāi)始測(cè)。
3）可能是模板降解。這種情況下，需要重新制備RNA模板或cDNA模板，重新實(shí)驗(yàn)。

 

 
擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖基線期異常
 
 


原因分析及解決方案：

在對(duì)數(shù)圖擴(kuò)增曲線中，若基線期為連續(xù)曲線，則有可能是基線期設(shè)置循環(huán)周期偏少造成。可以在設(shè)置中增大基線的終點(diǎn)值，調(diào)整后可恢復(fù)正常，如下圖所示：

 


 

 
擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖曲線分段
 
 


原因分析及解決方案：

在對(duì)數(shù)圖擴(kuò)增曲線中，若擴(kuò)增曲線基線期連續(xù)且后續(xù)出現(xiàn)明顯分段現(xiàn)象，則有可能是基線期設(shè)置循環(huán)周期偏多造成。可以在設(shè)置中減小基線的終點(diǎn)值，調(diào)整后可恢復(fù)正常，如下圖所示：


 

 
擴(kuò)增曲線線型圖不平滑
 
 

原因分析及解決方案：
1）PCR反應(yīng)管可能沒(méi)有蓋緊，當(dāng)儀器進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)，反應(yīng)液出現(xiàn)揮發(fā)、泄露。在上機(jī)前，建議用潔凈的手套或鑷子壓緊管蓋以避免該風(fēng)險(xiǎn)。
2）PCR反應(yīng)液在管中可能出現(xiàn)掛壁，在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)由于重力因素反應(yīng)液下滑或最終進(jìn)入反應(yīng)體系。在上機(jī)前，建議使用桌面小離心機(jī)對(duì)PCR管進(jìn)行離心，肉眼觀察無(wú)反應(yīng)液掛壁，上機(jī)過(guò)程小心為上，減少抖動(dòng)和碰撞發(fā)生。
3）可能是體系中抑制物較多，導(dǎo)致熒光不穩(wěn)定。當(dāng)RNA提取樣本充裕的情況下，建議重新提取高純度RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、熒光定量。當(dāng)RNA提取樣本缺失或稀少的情況下，建議稀釋cDNA后重新上機(jī)，減少抑制物的抑制作用。

 

 

4）可能是儀器開(kāi)機(jī)后長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行，使用過(guò)度，導(dǎo)致熒光收集不穩(wěn)定。建議讓儀器待機(jī)/關(guān)機(jī)一段時(shí)間后，重新開(kāi)啟運(yùn)行。

 

 
擴(kuò)增曲線線性圖無(wú)法到達(dá)平臺(tái)期
 
 

原因分析及解決方案：
1） 平臺(tái)期對(duì)Ct值影響不大。計(jì)算Ct值時(shí)，是通過(guò)閾值線(上圖綠色水平線)與擴(kuò)增曲線指數(shù)期的交叉點(diǎn)進(jìn)行的，故平臺(tái)期對(duì)于Ct值的影響不大。
2） 無(wú)法到達(dá)平臺(tái)期可能是因?yàn)檠h(huán)數(shù)設(shè)置太少，增加循環(huán)數(shù)可有助于觀察到明顯的平臺(tái)期。
3） 當(dāng)試劑擴(kuò)增效率比較低時(shí)，酶活力不持久，下降較快，平臺(tái)期也可能會(huì)出現(xiàn)不明顯的現(xiàn)象。可通過(guò)增加鎂離子濃度或更換效力更強(qiáng)的酶解決該問(wèn)題。

 

 
擴(kuò)增曲線線性圖平臺(tái)期“低頭"
 
 

原因分析及解決方案：
可能是基線選取的范圍不正確，其中的基線終點(diǎn)大于曲線對(duì)應(yīng)的Ct值。當(dāng)模板DNA投入過(guò)多時(shí)(投入高濃度cDNA原液或cDNA上樣比例＞20%)，基線范圍仍取為3-15，其中會(huì)包含部分?jǐn)U增信號(hào)，從而導(dǎo)致閾值線過(guò)高，對(duì)應(yīng)的平臺(tái)期在計(jì)算時(shí)會(huì)出現(xiàn)下滑現(xiàn)象。這種情況下，可減少基線期終點(diǎn)，重新分析數(shù)據(jù)。

 

 
擴(kuò)增曲線Ct值偏大
 
 

原因分析及解決方案：
1） 若目的基因在樣品中的豐度較低，則可能出現(xiàn)Ct值偏大的現(xiàn)象。該情況下可選擇增加反轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA的投入量或者減少cDNA的稀釋倍數(shù)可調(diào)整對(duì)應(yīng)的Ct值。當(dāng)RNA投入量是原先的2倍時(shí)，Ct值對(duì)應(yīng)可減少1(21=2);當(dāng)cDNA稀釋倍數(shù)由8倍調(diào)整為2倍時(shí)，Ct值對(duì)應(yīng)可減少2(22=4)。
2） 設(shè)計(jì)的目的片段過(guò)長(zhǎng)，僅部分目的片段在每個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增，從而導(dǎo)致Ct值偏大。建議將目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為80-200bp之內(nèi)，不建議超過(guò)300bp。
3） 體系中可能存在抑制劑，導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降，最終使得Ct值偏大。建議減少投入的模板量或重新制備純度更高的RNA。

 

 
擴(kuò)增曲線重復(fù)性差
 
 

原因分析及解決方案：
1） 可能是加樣誤差大導(dǎo)致的重復(fù)性差。儀器方面，需要每年對(duì)移液槍進(jìn)行一次校正。在操作方面，采取先加大體積后加小體積液體的方式。移液器使用時(shí)采取二檔吸液一檔出液的方式，若下一次移液不更換槍頭，則第二槍開(kāi)始一檔吸液一檔出液。
2） 試劑或預(yù)混體系沒(méi)有混勻，也會(huì)導(dǎo)致重復(fù)性偏差。建議在分裝反應(yīng)液前，先將反應(yīng)液以震蕩或吹打的形式進(jìn)行充分混勻。上機(jī)之前，將PCR管離心，使得所有的液體都在反應(yīng)管底部。
3） 儀器未使用ROX校正，則也可能發(fā)生重復(fù)性偏差的現(xiàn)象。最好選用ROX校正。當(dāng)所用試劑不含ROX時(shí)或ROX添加濃度不合適時(shí)，將ROX校正關(guān)閉。
4）當(dāng)基因本身豐度低或模板濃度低時(shí)，Ct值會(huì)在30以上，同時(shí)Ct值重復(fù)性差。該情況下，建議將復(fù)孔數(shù)增加至4-6個(gè)，從中適當(dāng)舍棄1-2個(gè)偏差較大的數(shù)據(jù)。

 

 
擴(kuò)增曲線雜亂無(wú)規(guī)律
 
 

原因分析及解決方案：

可能是ROX濃度與機(jī)型不能匹配造成這種現(xiàn)象。建議在設(shè)置中找到Passive Reference后將ROX改為None，重新分析即可獲取正常的擴(kuò)增曲線，如下圖所示。

 

 

 

熔解曲線異常
 
熔解曲線單峰但不尖銳
 
 

原因分析及解決方案：
可能存在大小相近的非特異擴(kuò)增，可以通過(guò)兩種方法進(jìn)行判斷，簡(jiǎn)單的方式是觀察起峰到落峰的溫度跨度，若跨度不大于7℃，則可視為單峰。另外相對(duì)復(fù)雜的方法是將產(chǎn)物進(jìn)行高濃度瓊脂糖電泳(如3%瓊脂糖)進(jìn)行輔助判斷。

 

 
熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之前
 
 

原因分析及解決方案：
引物二聚體在引物對(duì)之間存在部分序列同源性時(shí)會(huì)形成，其長(zhǎng)度通常會(huì)低于80bp，在70℃范圍區(qū)間會(huì)形成低熒光且更寬的波峰。具體的波峰大小會(huì)根據(jù)引物二聚體的大小和GC含量而發(fā)生變化。進(jìn)行熒光定量之前，檢查引物二聚體的方法有多種，可視化方法是進(jìn)行核酸電泳，形成的引物二聚體通常會(huì)在凝膠底部附近顯示為彌散帶。減少引物二聚體的方法如下：

  • 優(yōu)化熱循環(huán)條件，主要是提高退火溫度；

  • 降低引物濃度。在多數(shù)情況下，引物終濃度為200 nM，可選擇降低至60 nM；

  • 第一次針對(duì)一個(gè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物時(shí)，可嘗試設(shè)計(jì)三對(duì)引物組，選用其中高、特異性表現(xiàn)引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

 

 
熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之后
 
 

原因分析及解決方案：
1）可能是cDNA樣本中存在gDNA污染，引物設(shè)計(jì)時(shí)未跨內(nèi)含子造成的其他擴(kuò)增產(chǎn)物。建議設(shè)計(jì)引物時(shí)跨內(nèi)含子且不在單一外顯子模塊中設(shè)計(jì)，或在RNA提取時(shí)，選用帶gDNA去除的RNA提取試劑盒，或是在反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA時(shí)，選用帶gDNA去除的反轉(zhuǎn)錄試劑。
2）可能是引物特異性過(guò)差導(dǎo)致的非特異擴(kuò)增。建議將引物序列輸入至NCBI中進(jìn)行特異性分析，檢測(cè)在同物種中是否存在其他配對(duì)序列。

 

 
陰性對(duì)照(NTC)起峰且有熔解曲線峰
 
 
NTC：又稱為無(wú)模板對(duì)照，指除DNA或cDNA樣品以外的所有反應(yīng)組分。在這些對(duì)照中檢測(cè)到的擴(kuò)增通常是由于引物二聚體或擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物污染造成。這兩類污染會(huì)導(dǎo)致相關(guān)靶標(biāo)的表達(dá)水平被人為的升高。
Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃


原因分析及解決方案：

引物二聚體導(dǎo)致的非特異擴(kuò)增，具體解決方案可見(jiàn)上述【熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之前】。其中值得注意的點(diǎn)是，若實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組之間的Ct值差值遠(yuǎn)大于10，則表示引物二聚體對(duì)于靶標(biāo)片段擴(kuò)增的影響不大，數(shù)據(jù)可用于分析。

Ct值＜35，NTC熔解曲線與基因熔解曲線峰形重疊。

 


原因分析及解決方案：
這種情況下，多是由于體系中出現(xiàn)污染，例如水中、引物中、試劑中出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的模板，多為槍頭未更換帶來(lái)的交叉污染。該情況下，需要以控制變量的方式逐步排查污染源。

 

 
熔解曲線峰型雜亂
 
 

原因分析及解決方案：
1） 可能是反應(yīng)體系中出現(xiàn)污染，建議結(jié)合陰性對(duì)照結(jié)果確認(rèn)污染情況，從水、引物、酶和環(huán)境等注意排除污染。
2） 可能是熒光定量試劑暴露在強(qiáng)光或者高溫下導(dǎo)致試劑失效進(jìn)而導(dǎo)致該問(wèn)題出現(xiàn)，建議用新的熒光定量試劑進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。
3） 耗材與儀器不匹配，不能滿足熒光定量?jī)x器光源對(duì)于耗材的需求。這種情況下，需確認(rèn)儀器所對(duì)應(yīng)的耗材要求，選擇正確且質(zhì)量有保證的耗材進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。
4）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校正也可能會(huì)引發(fā)該情況。儀器方面建議每一年校正，以保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

 

 
熔解曲線前端起雜峰
 
 


原因分析及解決方案：
可能是ROX濃度與機(jī)型不能匹配造成這種現(xiàn)象。建議在設(shè)置中找到Passive Reference后將ROX改為None，重新分析即可獲取正常的熔解曲線，如下圖所示。

 

 

 

以上是對(duì)熒光定量PCR中問(wèn)題圖表分析及實(shí)驗(yàn)案例的介紹，相信小伙伴們通過(guò)小翌的介紹，對(duì)如何分析問(wèn)題圖表已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌會(huì)陸續(xù)在公眾號(hào)里傳授秘籍噠，敬請(qǐng)期待哦。

 

方法

分類

產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

RNA提取

同Trizol提取

TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent

10606ES

動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取，避開(kāi)有毒試劑，最快15 min完成

MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒

19221ES

簡(jiǎn)單植物總RNA提取，避開(kāi)有毒試劑，最快40min完成

MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒

19291ES

多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成

MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒

19292ES

細(xì)胞總RNA提取，避開(kāi)有毒試劑，最快8 min完成

MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒

19231ES

qPCR染料法

高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法)

Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix

11184ES

定量預(yù)混液 (染料法)，已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到5000+

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox)

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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox)

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高靈敏型qPCR預(yù)混液（染料法）

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox)

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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox)

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miRNA加A法高特異性定量預(yù)混液(染料法)

Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（加A法）

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miRNA莖環(huán)法高特異性定量預(yù)混液(染料法)

Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法）

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高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法)

Hifair®  III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit

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細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR，1.5 h從細(xì)胞到基因表達(dá)分析(染料法)

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit

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反轉(zhuǎn)錄試劑

5 min快速反轉(zhuǎn)，最長(zhǎng)可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-示蹤版

Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit

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5 min快速反轉(zhuǎn)，最長(zhǎng)可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-常規(guī)版

Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye）

11150ES

15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應(yīng)用qPCR)

Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR

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高鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES

最長(zhǎng)可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

11139ES

常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預(yù)混液,含gDNA去除（下游應(yīng)用qPCR）

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11123ES

miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法）

Hifair®  miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法）

11148ES



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