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漲知識|qPCR專場四:問題圖表分析及實驗案例
儀器界面展示處以7500為例
引物凍干粉在長時間儲存和儲存溫度上有著更強的靈活性和保障;
引物濃度對穩定性也會產生影響,不建議以低于10μM的濃度儲存引物,在大多數情況下,100μM的引物使用更加靈活容易;
引物或探針也需和RNA一樣分裝儲存,以盡可能減少反復凍融帶來的影響;
TE緩沖液的儲存環境比水更加穩定。
原因分析及解決方案:
在對數圖擴增曲線中,若基線期為連續曲線,則有可能是基線期設置循環周期偏少造成。可以在設置中增大基線的終點值,調整后可恢復正常,如下圖所示:
原因分析及解決方案:
在對數圖擴增曲線中,若擴增曲線基線期連續且后續出現明顯分段現象,則有可能是基線期設置循環周期偏多造成。可以在設置中減小基線的終點值,調整后可恢復正常,如下圖所示:
原因分析及解決方案:
可能是ROX濃度與機型不能匹配造成這種現象。建議在設置中找到Passive Reference后將ROX改為None,重新分析即可獲取正常的擴增曲線,如下圖所示。
優化熱循環條件,主要是提高退火溫度;
降低引物濃度。在多數情況下,引物終濃度為200 nM,可選擇降低至60 nM;
第一次針對一個靶標設計引物時,可嘗試設計三對引物組,選用其中高、特異性表現引物進行實驗。
引物二聚體導致的非特異擴增,具體解決方案可見上述【熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之前】。其中值得注意的點是,若實驗組和陰性對照組之間的Ct值差值遠大于10,則表示引物二聚體對于靶標片段擴增的影響不大,數據可用于分析。
方法 | 分類 | 產品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細胞總RNA提取,避開有毒試劑,最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取,避開有毒試劑,最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取,最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細胞總RNA提取,避開有毒試劑,最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養細胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預混液 (染料法),已發文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預混液(染料法) | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(加A法) | 11171ES | |
miRNA莖環法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(莖環法) | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細胞直擴RT-qPCR,1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉錄試劑 | 5 min快速反轉,最長可滿足14 kb cDNA合成,含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-示蹤版 | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉,最長可滿足14 kb cDNA合成,含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-常規版 | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit(No Dye) | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉錄(下游應用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
高鏈cDNA合成預混液,含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒,含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規30 min反轉預混液,含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉錄試劑盒(加A法) | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (加A法) | 11148ES |