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漲知識|qPCR專場四：問題圖表分析及實驗案例

2023-8-25　　閱讀(246)

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漲知識|qPCR專場四：問題圖表分析及實驗案例

 


熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產物的累積情況，從而達到對PCR過程進行實時監控的目的，并且可以通過數據分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源。
 
熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結果，發表高分文章呢？

 

在熒光定量PCR實驗中，難免會遇到一些奇怪的擴增曲線或熔解曲線，不管是開辟新課題新項目中的預實驗探索還是持續驗證中的反復測試，都有可能遇見。雖說異常曲線可能會千奇百怪，但仔細分析，了解清楚具體原因就有助于我們順利完成實驗，不用再投入更多時間精力重復實驗。

 

 

擴增曲線異常
 
無擴增曲線出現
 
 

 

原因分析及解決方案：
熒光定量儀器參數設置錯誤，上機前對應熒光信號采集開關沒有打開。可在問題數據的運行程序中檢查，相關采集開關是否正常開啟。若未正常開啟，則需要重新準備上機反應體系，設置好對應的參數，打開采集開關再次檢測。

 

 

儀器界面展示處以7500為例

 

 
有光信號但無Ct值
 
 

 

原因分析及解決方案：
擴增曲線線性圖顯示為一條筆直的線或對數圖的▲Rn不超過1且在低水平徘徊，則無擴增。
 
1）可能是引物降解帶來的影響。當引物儲存不當時會導致引物降解并失去特異性，進而降低擴增效率。可通過核酸電泳的方式檢測引物的完整性，若原先的特異性條帶變成彌散帶，則表示引物發生降解。針對引物保存，需考慮以下四個建議：

  •  引物凍干粉在長時間儲存和儲存溫度上有著更強的靈活性和保障；

  • 引物濃度對穩定性也會產生影響，不建議以低于10μM的濃度儲存引物，在大多數情況下，100μM的引物使用更加靈活容易；

  • 引物或探針也需和RNA一樣分裝儲存，以盡可能減少反復凍融帶來的影響；

  • TE緩沖液的儲存環境比水更加穩定。

2）可能是模板濃度太低造成檢測困難。建議減少cDNA稀釋濃度重復實驗即可，通常情況下，未知濃度的樣品先從原液開始測。
3）可能是模板降解。這種情況下，需要重新制備RNA模板或cDNA模板，重新實驗。

 

 
擴增曲線對數圖基線期異常
 
 


原因分析及解決方案：

在對數圖擴增曲線中，若基線期為連續曲線，則有可能是基線期設置循環周期偏少造成。可以在設置中增大基線的終點值，調整后可恢復正常，如下圖所示：

 


 

 
擴增曲線對數圖曲線分段
 
 


原因分析及解決方案：

在對數圖擴增曲線中，若擴增曲線基線期連續且后續出現明顯分段現象，則有可能是基線期設置循環周期偏多造成。可以在設置中減小基線的終點值，調整后可恢復正常，如下圖所示：


 

 
擴增曲線線型圖不平滑
 
 

原因分析及解決方案：
1）PCR反應管可能沒有蓋緊，當儀器進行熱循環時，反應液出現揮發、泄露。在上機前，建議用潔凈的手套或鑷子壓緊管蓋以避免該風險。
2）PCR反應液在管中可能出現掛壁，在反應進行時由于重力因素反應液下滑或最終進入反應體系。在上機前，建議使用桌面小離心機對PCR管進行離心，肉眼觀察無反應液掛壁，上機過程小心為上，減少抖動和碰撞發生。
3）可能是體系中抑制物較多，導致熒光不穩定。當RNA提取樣本充裕的情況下，建議重新提取高純度RNA進行反轉錄、熒光定量。當RNA提取樣本缺失或稀少的情況下，建議稀釋cDNA后重新上機，減少抑制物的抑制作用。

 

 

4）可能是儀器開機后長時間運行，使用過度，導致熒光收集不穩定。建議讓儀器待機/關機一段時間后，重新開啟運行。

 

 
擴增曲線線性圖無法到達平臺期
 
 

原因分析及解決方案：
1） 平臺期對Ct值影響不大。計算Ct值時，是通過閾值線(上圖綠色水平線)與擴增曲線指數期的交叉點進行的，故平臺期對于Ct值的影響不大。
2） 無法到達平臺期可能是因為循環數設置太少，增加循環數可有助于觀察到明顯的平臺期。
3） 當試劑擴增效率比較低時，酶活力不持久，下降較快，平臺期也可能會出現不明顯的現象。可通過增加鎂離子濃度或更換效力更強的酶解決該問題。

 

 
擴增曲線線性圖平臺期“低頭"
 
 

原因分析及解決方案：
可能是基線選取的范圍不正確，其中的基線終點大于曲線對應的Ct值。當模板DNA投入過多時(投入高濃度cDNA原液或cDNA上樣比例＞20%)，基線范圍仍取為3-15，其中會包含部分擴增信號，從而導致閾值線過高，對應的平臺期在計算時會出現下滑現象。這種情況下，可減少基線期終點，重新分析數據。

 

 
擴增曲線Ct值偏大
 
 

原因分析及解決方案：
1） 若目的基因在樣品中的豐度較低，則可能出現Ct值偏大的現象。該情況下可選擇增加反轉錄時RNA的投入量或者減少cDNA的稀釋倍數可調整對應的Ct值。當RNA投入量是原先的2倍時，Ct值對應可減少1(21=2);當cDNA稀釋倍數由8倍調整為2倍時，Ct值對應可減少2(22=4)。
2） 設計的目的片段過長，僅部分目的片段在每個循環中擴增，從而導致Ct值偏大。建議將目的擴增片段長度設計為80-200bp之內，不建議超過300bp。
3） 體系中可能存在抑制劑，導致擴增效率下降，最終使得Ct值偏大。建議減少投入的模板量或重新制備純度更高的RNA。

 

 
擴增曲線重復性差
 
 

原因分析及解決方案：
1） 可能是加樣誤差大導致的重復性差。儀器方面，需要每年對移液槍進行一次校正。在操作方面，采取先加大體積后加小體積液體的方式。移液器使用時采取二檔吸液一檔出液的方式，若下一次移液不更換槍頭，則第二槍開始一檔吸液一檔出液。
2） 試劑或預混體系沒有混勻，也會導致重復性偏差。建議在分裝反應液前，先將反應液以震蕩或吹打的形式進行充分混勻。上機之前，將PCR管離心，使得所有的液體都在反應管底部。
3） 儀器未使用ROX校正，則也可能發生重復性偏差的現象。最好選用ROX校正。當所用試劑不含ROX時或ROX添加濃度不合適時，將ROX校正關閉。
4）當基因本身豐度低或模板濃度低時，Ct值會在30以上，同時Ct值重復性差。該情況下，建議將復孔數增加至4-6個，從中適當舍棄1-2個偏差較大的數據。

 

 
擴增曲線雜亂無規律
 
 

原因分析及解決方案：

可能是ROX濃度與機型不能匹配造成這種現象。建議在設置中找到Passive Reference后將ROX改為None，重新分析即可獲取正常的擴增曲線，如下圖所示。

 

 

 

熔解曲線異常
 
熔解曲線單峰但不尖銳
 
 

原因分析及解決方案：
可能存在大小相近的非特異擴增，可以通過兩種方法進行判斷，簡單的方式是觀察起峰到落峰的溫度跨度，若跨度不大于7℃，則可視為單峰。另外相對復雜的方法是將產物進行高濃度瓊脂糖電泳(如3%瓊脂糖)進行輔助判斷。

 

 
熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之前
 
 

原因分析及解決方案：
引物二聚體在引物對之間存在部分序列同源性時會形成，其長度通常會低于80bp，在70℃范圍區間會形成低熒光且更寬的波峰。具體的波峰大小會根據引物二聚體的大小和GC含量而發生變化。進行熒光定量之前，檢查引物二聚體的方法有多種，可視化方法是進行核酸電泳，形成的引物二聚體通常會在凝膠底部附近顯示為彌散帶。減少引物二聚體的方法如下：

  • 優化熱循環條件，主要是提高退火溫度；

  • 降低引物濃度。在多數情況下，引物終濃度為200 nM，可選擇降低至60 nM；

  • 第一次針對一個靶標設計引物時，可嘗試設計三對引物組，選用其中高、特異性表現引物進行實驗。

 

 
熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之后
 
 

原因分析及解決方案：
1）可能是cDNA樣本中存在gDNA污染，引物設計時未跨內含子造成的其他擴增產物。建議設計引物時跨內含子且不在單一外顯子模塊中設計，或在RNA提取時，選用帶gDNA去除的RNA提取試劑盒，或是在反轉錄獲取cDNA時，選用帶gDNA去除的反轉錄試劑。
2）可能是引物特異性過差導致的非特異擴增。建議將引物序列輸入至NCBI中進行特異性分析，檢測在同物種中是否存在其他配對序列。

 

 
陰性對照(NTC)起峰且有熔解曲線峰
 
 
NTC：又稱為無模板對照，指除DNA或cDNA樣品以外的所有反應組分。在這些對照中檢測到的擴增通常是由于引物二聚體或擴增的PCR產物污染造成。這兩類污染會導致相關靶標的表達水平被人為的升高。
Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃


原因分析及解決方案：

引物二聚體導致的非特異擴增，具體解決方案可見上述【熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之前】。其中值得注意的點是，若實驗組和陰性對照組之間的Ct值差值遠大于10，則表示引物二聚體對于靶標片段擴增的影響不大，數據可用于分析。

Ct值＜35，NTC熔解曲線與基因熔解曲線峰形重疊。

 


原因分析及解決方案：
這種情況下，多是由于體系中出現污染，例如水中、引物中、試劑中出現對應的模板，多為槍頭未更換帶來的交叉污染。該情況下，需要以控制變量的方式逐步排查污染源。

 

 
熔解曲線峰型雜亂
 
 

原因分析及解決方案：
1） 可能是反應體系中出現污染，建議結合陰性對照結果確認污染情況，從水、引物、酶和環境等注意排除污染。
2） 可能是熒光定量試劑暴露在強光或者高溫下導致試劑失效進而導致該問題出現，建議用新的熒光定量試劑進行對比試驗。
3） 耗材與儀器不匹配，不能滿足熒光定量儀器光源對于耗材的需求。這種情況下，需確認儀器所對應的耗材要求，選擇正確且質量有保證的耗材進行重復試驗。
4）儀器長時間未校正也可能會引發該情況。儀器方面建議每一年校正，以保證數據的穩定性。

 

 
熔解曲線前端起雜峰
 
 


原因分析及解決方案：
可能是ROX濃度與機型不能匹配造成這種現象。建議在設置中找到Passive Reference后將ROX改為None，重新分析即可獲取正常的熔解曲線，如下圖所示。

 

 

 

以上是對熒光定量PCR中問題圖表分析及實驗案例的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何分析問題圖表已經有一定的了解啦。關于如何做好qPCR實驗，小翌會陸續在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。

 

方法

分類

產品名稱

貨號

RNA提取

同Trizol提取

TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent

10606ES

動物組織/細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成

MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒

19221ES

簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成

MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒

19291ES

多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成

MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒

19292ES

細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成

MolPure® Cell RNA Kit 培養細胞RNA提取試劑盒

19231ES

qPCR染料法

高靈敏通用型定量預混液(染料法)

Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix

11184ES

定量預混液 (染料法)，已發文章累計IF達到5000+

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

11201ES

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox)

11202ES

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox)

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高靈敏型qPCR預混液（染料法）

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

11198ES

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox)

11199ES

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox)

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miRNA加A法高特異性定量預混液(染料法)

Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（加A法）

11171ES

miRNA莖環法高特異性定量預混液(染料法)

Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（莖環法）

11170ES

高靈敏一步法反轉定量試劑盒(染料法)

Hifair®  III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit

11143ES

細胞直擴RT-qPCR，1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法)

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit

11172ES

反轉錄試劑

5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-示蹤版

Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11149ES

5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-常規版

Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye）

11150ES

15 min一步完成gDNA去除與反轉錄(下游應用qPCR)

Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR

11142ES

高鏈cDNA合成預混液，含gDNA去除(下游應用qPCR)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES

最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

11139ES

常規30 min反轉預混液,含gDNA去除（下游應用qPCR）

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11123ES

miRNA反轉錄試劑盒（加A法）

Hifair®  miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法）

11148ES



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