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破骨細胞培養高成功率的關鍵——高活性RANKL和M-CSF

2023-8-22  閱讀(423)

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01
破骨細胞及其作用


破骨細胞是一種高度分化的多核巨細胞,主要來源于單核/巨噬細胞造血干細胞系,是骨組織吸收的主要功能細胞,參與貫穿生命始終的骨重建過程。建立破骨細胞體外培養方法有利于從細胞與分子水平進行骨吸收機制的研究,也有利于骨質疏松癥、骨硬化癥等代謝性骨病治療藥物的開發研究。因此,為了深入研究破骨細胞的形成機制并尋找其在疾病治療中的應用,誘導分化破骨細胞成為了一個研究熱點。
 
破骨細胞由血液及骨髓中的單核/巨噬細胞系分化而來,其分化過程經歷破骨細胞前體(osteoclast precursor cells,OPCs,或稱preosteoclasts)、融合的多核破骨細胞(non-functional polykaryons)、成熟破骨細胞(mature osteoclasts,也稱極化的多核破骨細胞)等幾個階段。骨骼是一種動態組織,在結構應力和人體對鈣的需求等影響下,骨骼不斷被分解和重組。破骨細胞是骨骼持續破壞的介質,在骨發育、生長、修復、重建中具有重要的作用。

 

圖1.破骨細胞分化過程圖[1]

 

 

02
破骨細胞標志物
破骨細胞占據骨頭表面的小凹陷,稱為Howship腔隙;這種腔隙被認為是由破骨細胞的酶對骨骼的侵蝕引起的。破骨細胞產生許多酶,其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acidic phosphatase, Trap),Trap特異地分布于破骨細胞中,為破骨細胞所,通常作為鑒別破骨細胞的重要標志物。

 

 

03
破骨細胞的獲得

在破骨細胞分化成熟的過程中,RANK /RANKL/OPG系統起著分化調控樞紐的作用,是調節破骨細胞分化成熟的關鍵信號途徑。核因子κB 受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κBLigand,RANKL)被認為是促進破骨細胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子,M-CSF可誘導RANK在破骨細胞前體的細胞膜上表達,進而使表達RANK的破骨前體細胞和RANKL結合并產生效應,誘導破骨細胞分化。因此在體外誘導破骨細胞分化過程中RANKL和M-CSF兩種細胞因子缺一不可。現在破骨細胞主要采用的誘導法是骨髓單核細胞誘導法和RAW264.7細胞系誘導法。

 

 

小鼠骨髓單核細胞誘導

 
 

實驗方案:

 

取6-17周齡小鼠,使用CO2吸入或頸椎脫臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。

 

小心地取出股骨和脛骨,并將其放入10厘米的培養皿中。

 

無菌條件下準備股骨和脛骨:

  1. 盡可能使用鑷子和剪刀去除所有皮膚、肌腱和肌肉。

  2. 用手術刀或剪刀切掉所有骨頭的兩端。

  3. 使用5ml注射器和23-G針頭在新鮮培養皿中用10ml破骨細胞培養基從所有骨頭中沖洗出骨髓。丟棄已沖洗的骨骼。

  4. 使用1ml注射器和27-G針頭,通過將細胞懸浮液吸入注射器和從注射器中抽出,盡可能分離細胞聚集體。然后,通過70µm細胞過濾器沖洗細胞懸液,并將其放入50 ml錐形離心管中。

  5. 用2ml培養基沖洗細胞過濾器的尼龍網。

 

獲得的細胞懸液300×g,4°C下離心7min,棄上清。

 

用5ml紅細胞裂解液重懸細胞。冰上裂解10min。

 

離心,棄上清。再用5ml含10%FBS的 α-MEM培養基重懸,離心,棄上清。

 

用5ml含M-CSF (25 ng/ml)和10%FBS的 α-MEM培養基重懸細胞。接種于6孔細胞培養板中(每只小鼠一孔),置于37°C、5%CO2細胞培養箱中過夜(14至18小時)。

 

第二天,吸取培養基,收集未粘附的細胞,注意勿刮擦平板底部。將培養基轉移至50ml錐形離心管中。300×g,4℃,離心7min,棄上清。

 

用5ml含10%FBS的 α-MEM培養基重懸細胞,并使用細胞計數裝置計數活細胞。

 

以1×106cells/ml密度接種于培養板上,并加入M-CSF(50ng/ml)和RANKL(25–100 ng/ml)。

 

3天后更換培養基。第五天左右一般能觀察到多核成熟破骨細胞。

 

TRAP染色鑒定破骨細胞。

注意:

  1. 使用的RANKL和M-CSF濃度可能因小鼠和實驗室條件而異。

  2. 從RANKL和M-CSF添加后的第4天起,每天至少觀察一次細胞,因為小鼠破骨細胞在分化后非常不穩定。破骨細胞形成初期,細胞呈紡錘形,成熟后,細胞變大,多核,呈圓形。與人類破骨細胞相反,小鼠破骨細胞在成熟后24小時內死亡。

 

 

由巨噬細胞系RAW264.7誘導破骨細胞

 
 

實驗方案:

 

用含10%FBS的α-MEM培養基將RAW264.7細胞制成細胞懸液,以3×104 cells/孔的密度接種于24孔板中。

 

細胞接種12h后,加入RANKL(20-100ng/ml)。

 

每3天更換培養基,并同時補加RANKL(20-100ng/ml)。

 

較為明顯的多核破骨細胞將在分化培養4天后開始出現,并在第5天至第6天逐漸變得豐富。

 

進行TRAP染色,鑒定破骨細胞形成情況。

注意:

  1. RAW264.7細胞在含有10%FBS的RPMI-1640或DEME培養基中可以增殖并保持其分化為破骨細胞的能力,而其在含有10%FBS的α-MEM中培養可進行破骨細胞分化試驗。

  2. RAW 264.7細胞表達M-CSF及其受體c-fms。因此,僅加入RANKL就足以誘導破骨細胞分化,無需額外加入M-CSF。

(*以上方案供參考,根據實驗情況具體優化)

 

 

04
產品特點

破骨細胞能否誘導成功影響因素眾多,其中調節信號通路的關鍵細胞因子至關重要。翌圣生物提供高活性HiActi™細胞因子RANKL和M-CSF,高純度、高質量,助力破骨細胞培養。

 

 

數據展示

 
 

高純度(>95%)

 

高活性(Cell based assay)

 

 

05
相關產品信息

 

產品名稱

貨號

規格

Mouse RANKL

90630ES08

5 μg

Mouse M-CSF

91114ES10

10 μg

Human RANKL

90629ES50

50 μg

Human M-CSF

91103ES10

10 μg

 

參考文獻

[1]William J. Boyle*, W. Scott Simonet? & David L. Lacey.Osteoclast differentiation and activation.Nature, 423, pages337–342 (2003).

 



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