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熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產物的累積情況，從而達到對PCR過程進行實時監控的目的，并且可以通過數據分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源。
熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結果，發表高分文章，走上人生呢？
對于熒光定量PCR反應體系而言，cDNA模板的質量至關重要。cDNA模板的濃度、純度、是否有一定程度的降解等等，都會影響熒光定量PCR的實驗結果。絕大多數情況下，cDNA的質量和對應的RNA質量密切相關，高質量的RNA保證了高質量的cDNA。
基于有機試劑的一步萃取是一種非常有效的方法，能夠從多種細胞和組織中分離純化RNA。通常使用苯酚和異硫氰酸胍混合物(類似trizol)來破壞細胞并溶解細胞成分，同時異硫氰酸胍是一種離液鹽，可保護核酸免受RNase的侵害以保證核酸的完整性。后加入氯仿并通過離心可將混合物分離成水相和有機相。在異硫氰酸胍存在下，RNA僅保留在水相中，而DNA和蛋白質則轉移到有機相和中間相中，最后通過異丙醇沉淀從水相中回收RNA。
該過程相對來說較快，可以產生較多的RNA，但是其中需要使用有毒的化學物質，與其他RNA提取方法相比，可能導致更高的DNA殘留。殘留剩下的胍、苯酚或醇也會顯著降低cDNA的合成效率。
使用硅膠膜或磁珠的方法時，生物樣本會在異硫氰酸胍存在下進行裂解和均質(均質：由不同的成分互不相溶而產生均勻的混合物)。均質化后，將乙醇加入樣品中，RNA會與硅膠膜或磁珠結合，并通過洗滌的方式去除雜質。該方法相較于有機萃取更省時，并且不需要苯酚。RNA產量可能沒有有機萃取方式來的高，但是蛋白質、脂質、多糖、DNA等殘留明顯減少。當然，由于不洗滌，仍有可能發生胍和乙醇的殘留，對cDNA合成效率產生一定的影響。
通常有機裂解和硅膠吸附相結合，可以做到樣本充分裂解，RNA提取更加簡便、快速和高純度。
生物樣品收集后快速置于液氮冷凍以快速阻止內源RNase 活性，裂解時快速操作滅活 RNase。
組織勻漿是提高RNA得率和降低RNA降解的關鍵。
選擇合適的抽提方法提取，例如脂肪組織最好用含苯酚的方法。
降低外源酶的污染，不能從外面又導入酶，盡可能杜絕環境來源的核酸酶。
洗滌時，一定要將核酸懸浮起來以保證殘留的鹽被洗去。同時，在倒掉乙醇后，立即高速離心數秒，再用移液器去除殘留的乙醇。室溫靜置 5-10分鐘后，再進行溶解。
溶解 RNA，必要時溶解的水進行 65℃加熱 5 分鐘。
cDNA 文庫構建對RNA完整性要求高，熒光定量PCR對完整性要求不是很高,但對純度 （酶抑制物殘留） 要求很高。
選用合適的RNA保存方法，短時間可以–20℃ 保存，長期請保存于–80℃。
常見評估RNA質量的方法有四種，分別是紫外光譜法(分光光度計測量)、核酸電泳、Qubit熒光測量和毛細管電泳分析法。
紫外光譜法是一種傳統且簡單的測量方法，大多數實驗室均配備分光光度計。通常會檢測三個值，分別是A230、A260和A280。
A230是鹽類、多糖、有機溶劑等最高吸收峰的吸收波長，包括胍、EDTA、TritonTMX-100、Trizol、乙醇、多糖等最高吸收峰均接近230 nm。
A260是核酸最高吸收峰的吸收波長，由于核酸結構中的芳香堿基部分，包括嘧啶堿基（T、C、U）與嘌呤堿基（A、G）的最高吸收峰均在260 nm，因此A260值可用于核酸定量計算。
A280是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，蛋白質中色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸與胍氨酸的芳香氨基酸鏈與有機化合物中的芳香性苯酚的最高吸收峰均接近280 nm。
其中A260/A280＞2.2表示RNA降解常為經驗判斷，并沒有文章驗證依據。判斷RNA是否發生降解辦法是跑電泳進行鑒定。
紫外光譜法雖然高效方便，但其也存在一定的不足。紫外吸光度可能會受到以下幾點的影響：
游離核苷酸的存在。吸光度不能區分核酸和游離核苷酸。并且游離核苷酸在 260 nm 處比核酸吸收更多，數值會受干擾，而非真實數據。
紫外吸光度測量無法區分同一樣品中的RNA和DNA。
純化核酸樣品中通常存在的污染物(例如蛋白質)有助于紫外吸光度讀數。
另一種常見的RNA質量評估方法是瓊脂糖凝膠電泳。該方法可以判斷RNA樣本的降解情況、基因組殘留和蛋白殘留情況。
▲高質量的RNA電泳會有三條比較明顯的條帶，分別是28S，18S與5S核糖體RNA條帶，并且28S與18S的條帶亮度之比大體為2：1。當RNA出現降解時，條帶會呈現彌散狀
▲當基因組DNA有殘留時，泳道上部會有明顯的高分子DNA條帶
▲當存在蛋白殘留時，點樣孔中會有比較亮的著色成分
當RNA樣本中存在基因組DNA(gDNA)殘留時，可能會在下游PCR實驗或者下游熒光定量PCR實驗中出現非特異擴增。在熒光定量PCR中直接的表現是Ct值明顯偏小，且熔解曲線出現雙峰。
目前有三種方法可以避免RNA樣本中gDNA的干擾。其中的方法是做好引物設計，跨內含子且不在單個外顯子模塊中設計上下游引物。
當引物設計不可避免或已完成了引物合成，則可以在RNA提取時選取帶有gDNA去除功能的RNA提取試劑盒或在反轉錄獲取cDNA時選用帶有gDNA去除功能的反轉錄試劑盒。
在正式進行cDNA合成之前，我們需要明確cDNA合成的模板是什么，是作用于RNA沉默和基因表達轉錄后調控的MicroRNA？還是涉及多個細胞過程的小型非編碼RNA？還是將DNA信息轉錄為蛋白質產物氨基酸序列的mRNA？還是其他類型的RNA？不同的RNA合成cDNA所需要的引物會有所不同，應按需調整。
以RNA為模板合成第一鏈cDNA的過程為反轉錄。該步驟是反轉定量中變化最大的一步，該步驟中可以使用隨機引物、Oligo dT或序列特異性引物，引物選擇在反轉錄效率、一致性和準確性上有著重要的作用。
Oligo dT引物是常見反轉錄反應的，因為其對mRNA具有特異性，并且可以從同一cDNA庫中分析許多不同的靶標。然而，由于其總在轉錄本RNA的3'末端啟動反轉錄，二級結構的存在可能導致cDNA合成不完整。
隨機引物能夠產生大量的cDNA，其在熒光定量 PCR 中具有最高的靈敏度。同時隨機引物也是無poly A尾RNA的理想選擇，例如原核生物RNA。隨機引物在整個RNA轉錄本中退火，產生多個擴增位點，從而能夠產生含有不同長度的cDNA。降解的RNA和復雜的二級結構對隨機引物不會造成太大的影響。隨機引物可以提高產量，但單獨使用也會產生拷貝數被高估的風險。隨機引物和Oligo dT引物的組合通常可以通過在同一反轉錄反應中結合兩者的優點來以提高cDNA的質量。
基因特異性引物具有最大的特異性，并且是反轉錄引物選擇中最為一致的。然而，這類引物沒有Oligo dT和隨機引物的靈活性，只產生靶基因產物所對應的cDNA。
在正式測量cDNA濃度之前，可能需要了解一下，cDNA濃度是否需要測量？通常反轉錄后所獲得的cDNA產物是一個混合體系，其中包含cDNA、未反轉錄的RNA、游離的核苷酸(dNTP)、殘余的引物以及各類蛋白和鹽離子等成分，會干擾cDNA的吸光值，從而影響判斷。
尤其是dNTP，該成分對于紫外光譜的影響較大。經實驗驗證，反轉錄體系中dNTP 投入量的多少會使cDNA濃度的測定結果產生較大差異，但最終Ct值幾乎一致，qPCR檢測結果△Ct＜1。
▲Nanodrop定量結果統計表
▲qPCR檢測結果△Ct＜1，且Ct值與 Nanodrop 定量結果無線性關系
cDNA濃度的測定受多因素影響，故可以選擇不進行cDNA濃度的測定。另外同一批RNA濃度調整后，默認同一批次做的反轉錄效率是一致的，cDNA和RNA投入量呈現線性正相關，cDNA的濃度高低后續可通過熒光定量PCR反應中的內參數據來反映。故而在進行cDNA合成時，保證好高質量無降解的RNA，即可獲取高質量的cDNA及準確的實驗數據。
以上是對如何獲取高質量cDNA的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何獲取高質量cDNA已經有一定的了解啦。關于如何做好qPCR實驗，小翌會陸續在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。
方法 | 分類 | 產品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養細胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預混液 (染料法)，已發文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細胞直擴RT-qPCR，1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉錄試劑 | 5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-常規版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉錄(下游應用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
一鏈cDNA合成預混液，含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規30 min反轉預混液,含gDNA去除（下游應用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
