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新品 | HEK293殘留DNA片段分析Kit，輕松實現HCD片段大小質控
2023-6-12 閱讀(364)
HEK293細胞是一種人胚腎細胞系，因其對生長和培養環境要求不高、易于轉染，以及相比于常用的CHO細胞翻譯后修飾（PTM）能力更為強大的特點，目前在工業內也被廣泛用于抗體蛋白生產、疫苗中的病毒樣顆粒生產、細胞和基因治療中的病毒載體生產等領域。但也有實驗證明，HEK293注入裸鼠中可成瘤，所以HEK293宿主細胞殘留成分是生物制品質量控制中一個重要環節，需要被控制在可接受的水平。嚴格的純化工藝可以去除一部分宿主細胞DNA（HCD）等殘留雜質成分，但產品中仍然可能會有HCD殘留，這些殘留的外源宿主細胞DNA會引發潛在的安全問題（如潛在致瘤性、傳染性，甚至增加免疫源性或導致突變），所以HCD檢測項目是生物制品生產工藝中重要的質量檢測指標之一。WHO和各國藥物注冊監管機構均對生物制品中外源宿主DNA殘留提出了監測和控制要求，以確保生物制品的安全性及質量可控性。WHO和美國FDA現行指導方針推薦成品中殘留DNA不高于10 ng/劑，美國FDA還指出生物制品宿主細胞DNA殘留DNA不高于100 pg/劑。歐洲藥典通則規定生物制品殘留DNA限度大多為不超過10 ng/劑。中國藥典2020年版三部規定，以細胞基質生產的生物制劑外源宿主細胞DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細菌或真菌基質生產的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑。除需對DNA的殘留量進行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關風險因素的重要指標。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp有可能會有一定的致病性，而且殘留DNA片段越大，生物制品的風險等級越高。DNA片段大小對應風險等級如下表：DNA片段大小風險等級劃分
注：風險程度依據風險等級遞增
美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》行業指南中建議將非致瘤性連續細胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。2022年5月，國家藥品監督管理局藥品評審中心（CDE）發布的體內基因治療產品要學研究與評價技術指導原則（試行）中也明確指出，需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。目前，檢測宿主細胞殘留DNA含量的方法都相對成熟，而且藥典法規也有明確規定，如《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染料色法和定量PCR法。然而，關于殘留DNA片段大小的檢測與分析，目前還沒有特定推薦的方法。目前，行業內對于殘留宿主細胞DNA片段分析，主要是利用毛細管電泳的方法。研究者們開發了一種基于毛細管凝膠電泳與敏感激光誘導熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數宿主細胞殘留DNA片段大小為50-2000bp。除了毛細管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進行生物制品中生產用細胞相關的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。針對上述情況，翌圣生物自主研發了HEK293殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設計了四種不同的擴增片段（82bp、133bp、227bp、515bp），用于定量檢測樣本中HEK293宿主細胞殘留DNA片段的大小分布情況。樣本類型包括：慢病毒上清液、腺相關病毒AAV上清液、HEK293細胞裂解液等。還研發了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。符合法規：按照Chp、USP、ICH等要求進行全面驗證，性能符合中外法規標準；保障品質：試劑盒原材料全自主研發，qPCR Mix等酶產品在超潔凈酶工廠生產；配合審計：保障試劑盒生產工藝穩定，批間差可控，有完善的審計文件；專屬性強：特異性檢測HEK293細胞殘留DNA，不受其他外源基因組DNA干擾；防干擾強：添加UDG酶，消化常規產物氣溶膠污染，防止非特異性擴增產品 | 貨號 | 品名 | 規格 |
樣本前處理試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18462ES | MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預封裝） | 2×16T/6×16T |
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核酸提取儀器 | 80501ES | Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A全自動核酸提取儀 | 32通量 |
殘留DNA片段分析試劑盒 | 41316ES | HEK293 Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit HEK293 宿主細胞殘留 DNA 片段分析試劑盒 | 4×50T/4×100T |
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[1]《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》，國家藥品監督管理局藥品審評中心，2022年5月。[2] 閆璐瑤等，宿主細胞殘留DNA片段大小分布檢測方法的建立及驗證[J].中國生物制品學雜志，2021年3月第34卷第3期。[3] U.S. FDA. Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs).
